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嵌合抗原受体:细胞和基因治疗远景

2017-09-18 08:01:27生物制品圈

嵌合抗原受体(CAR)是重新编程T淋巴细胞以靶向所选择的抗原的合成受体。 CD19是在在白血病和淋巴瘤细胞表面广泛表达的分子,被成功应用于临床,CAR治疗在“癌症免疫治疗”是一种特殊的挑战,是2013年的重大突破。CD19 CAR疗法基于遗传工程,T细胞生物学,肿瘤免疫学,合成生物学,靶标鉴定,细胞制造科学和法规,遵从CAR治疗的中心原则。 在这里,我们综述了其中的两个基础:基因工程方法和工程细胞类型。

嵌合抗原受体(CAR)是将T细胞靶向特定的抗原并重编程T细胞功能,代谢和稳定性的合成受体。通过其细胞外结构域,与主要组织相容性复合体(MHC)独立地结合细胞表面分子,与生理上的T细胞受体相反,其结合成MHC /肽复合物。嵌合抗原受体可能因此靶向蛋白质,碳水化合物或糖脂,并且与患者HLA单体型无关。与抗原结合触发T细胞激活,其通常由CD3-z链的细胞质膜结构域介导。然而,仅提供T细胞激活不足以指导生产性免疫回应。提CAR整合到一个共刺激结构域,可以使T细胞达到在反复曝光给抗原后保留其功能。这些受体已被称为第二代CAR和成为设计稳定T细胞的关键,构成“活毒药”攻击肿瘤且保留其功能。几篇最近的综述已经讨论CAR设计,实体瘤的CAR前景和T细胞制造业。

靶向CD19是在白血病和淋巴瘤细胞表面广泛表达的分子,被成功应用于临床,CAR治疗在“癌症免疫治疗”是一种特殊的挑战,是2013年的重大突破。CD19 CAR疗法基于遗传工程,T细胞生物学,肿瘤免疫学,合成生物学,靶标鉴定,细胞制造科学和法规,遵从CAR治疗的中心原则。 所有这一切需要启用创新的1期临床试验(图1)。 我们在这里综述作为现在的和即将到来的CAR疗法的基础,载体和细胞。

 

载体
r-逆转录病毒和慢病毒载体

T细胞工程的实施始于选择合适遗传修饰原发性淋巴细胞。第一个成功尝试是利用亲和r-逆转录病毒载体转导丝裂原活化的小鼠T细胞。这种方法不适用于人类T细胞,包括长臂猿白血病病毒(GALV)包膜以介导逆转录病毒载体进入。这些进展对于开发小鼠和人类T细胞是至关重要的,迄今为止仅限于转染外周血白细胞白血病细胞系或杂交瘤的工程,其不包括正常T细胞增殖的几个关键特征,功能和存活。现在可以研究受体和信号分子,在正常的T细胞很容易从外周血中收获。逆转录病毒载体最终将成为第一个在文中进行评估的基于T细胞的疗法,并且至今继续用于CAR治疗。

源自鼠白血病病毒的逆转录病毒载体需要目标细胞分裂以允许病毒整合。这个特征最终被利用来优先转换循环的混合T细胞群体内的T细胞。相比之下,慢病毒载体基于HIV-1预处理的核易位能力能够成功感染非分裂细胞。 然而,慢病毒需要非分裂细胞至少进行到细胞周期的G1b阶段以支持反向转录并允许完成逆转录病毒整合。尽管已经报道了慢病毒载体能够转染没有S期进展的细胞活化的T细胞,但是慢病毒载体通常在体外用于r-逆转录病毒激活T细胞。

r-逆转录病毒载体和慢病毒载体都将半自由地整合到人类基因组中,具有类似于转录基因区域的偏好,但是具有一些差异(前者靠近转录起始位点,后者分布更均匀)。 据认为,这种微妙的差异有助于慢性病毒载体在造血前体中的较小的遗传毒性。然而,鉴于与所遇到的致癌T细胞转化的罕见性,逆转录病毒载体类型与T细胞治疗之间的这种差异的相关性是不确定的 r逆转录病毒药物。 逆转录病毒载体的另一个特征是它们在逆转录过程中产生的突变率约为5倍,对于HIV-1逆转录酶与莫洛尼白血病病毒(Mo-MLV)相比。

DNA转座子

r-逆转录病毒和慢病毒载体是复杂的生物试剂,这需要昂贵的生物安全测试和存储。 非病毒的方法将是有利的,只要它们是有效的。The Sleeping Beauty转座子/转座酶系统已通过电穿孔将CAR引入T细胞。相对而言,这个系统的优势是其简单的制造程序,低成本和简单的测试。 整合是随机的,诱变继发潜在的致癌风险。正在进行的CD19 CAR T细胞试验使用The Sleeping Beauty转座子/转座酶显示低T细胞毒性,通过这种方法产生的CAR T细胞的功效仍然是需要被证明的。

RNA转染

与提供的稳定和永久的转基因表达相反,通过逆转录病毒感染或质粒DNA转染,可以在电穿孔或内吞作用后获得瞬时表达体外转录的信使RNA(mRNA)。 这种方法消除了基因毒性和潜在产生复制型逆转录病毒的担忧。 RNA转染允许表达的转基因长达1周,并已用于递送mRNA,给生理T细胞受体(TCR)/ CAR,趋化因子受体,和细胞因子。这种方法可能有利于筛选可能与正常交叉反应的潜在有毒的CAR分子组织。 Beatty和同事发现重复转染mRNA转导的CAR-T细胞在一些病人身上可引起抗肿瘤作用。

基因组编辑

基因组编辑技术进一步扩展了人类细胞工程的应用。四种技术基于靶核酸酶,包括大核苷酸酶,锌指核酸酶(ZFN),转录活化剂样效应核酸酶(TALENs),和CRISPR / Cas9,打断人类基因组。例如,目前有ZFNs和CRISPR / Cas9,是最开发的工具,并已被使用有效靶向HIV共同受体CCR5。基因编辑技术也被用来编辑TCR基因等(例如PD-1),进一步增大了T细胞工程的可能性。第一个概念验证研究报告提到,特异性破坏TCRa的TALEN的电穿孔和CD52分子能够产生现成的来自第三方健康捐赠者的CAR T细胞。我们最近证明了这一点,敲入CAR cDNA到TCR基因座,改善CAR表达和信号传导,导致优异的抗肿瘤活性。 T细胞基因组编辑显着提高工程化T细胞治疗效果的潜力。

细胞
自体T细胞

自体T细胞是T细胞工程的逻辑起点,因为他们不会攻击接受者或被接收者拒绝,因为他们的自我起源。不同于肿瘤浸润T细胞的分离,它们不需要外科手术,可以简单从血液中收集。工程化的T细胞必须能够迁移到肿瘤部位,并维持到足够长的功能以根除肿瘤。虽然CAR本身重新定位和重新编程遗传修饰的淋巴细胞,引发T细胞的天然特性可影响治疗效力。离开后胸腺,天然T细胞(TN)分化成不同的子集,在保护性免疫中起特殊作用,包括记忆力(TSCM),中央记忆(TCM),效应记忆(TEM),组织驻留记忆(TRM)和效应(TE)细胞,分别具有不同的功能和维持时间,TN,TSCM和TCM子集的遗传修饰似乎更适合增强治疗功效。

同种异体T细胞

自体方法被证明在临床上有良好的记录,但个性化的制造强加了很多限制,并且在某些情况下可能是具有挑战性的,例如在患者中化疗或HIV诱发的免疫缺陷,或在小婴儿。

自体T细胞疗法的有希望的临床结果,如果有效和组织相容的T细胞容易获得,可以进一步扩大。尽管T细胞可以容易地从供体收获,但是他们的使用受到他们的同种异体反应的限制。这个特点强调了在供体来源的受体中T细胞移植受者和移植排斥反应的高风险的移植抗宿主病(GVHD)。提供可接受的风险收益比,供体T细胞必须缺乏同种异体反应潜力。目前有两种策略,基于病毒特异性T细胞的选择或TCR表达的消除。病毒特异性T细胞缺乏同种异体反应,是CAR介导的肿瘤的一种潜在的细胞载体定位。尽管不能预见性地消除同种异体反应和意想不到的TCR交叉反应,但是最近的研究表明对具有GVHD风险有限的多个接受者可以施用病毒特异性T细胞。因此,病毒特异性T细胞(VST)可用作TCR或CAR治疗的细胞载体。评估VSTs表达CAR的第一个试验发现,T细胞响应于病毒再活化而扩增,尽管抗肿瘤活动不大。研究最近揭示了同时使用TCR和CAR功能的T细胞。因此,另一种方法在于消除TCR表达,现在可以使用目标核酸酶。 TCR缺失淋巴细胞不能介导GVHD反应性,但它们的长期稳定性可能会受到影响,因为内稳增殖部分依赖于TCR-MHC相互作用。此外,基因编辑技术仍处于早期阶段开发并需要优化以提供有效的定位和没有遗传毒性以合理的成本。最后,应该注意防止GVHD的潜力不能引发相反的受体的反应,对于治疗免疫功能低下者供体T细胞排斥因此受到限制。因此,供体T细胞应用仍然是劳动密集型的,被成熟T细胞的复制潜力所限制。

替代T细胞来源:淋巴祖细胞和多能干细胞

淋巴细胞工程不限于成熟的T细胞,也可能是在淋巴样前体中进行。 T细胞祖细胞可以在体外生成,并被移植到MHC屏障上,产生限于宿主MHC的T细胞。用CAR,同种异体淋巴祖细胞产生肿瘤靶向也可能产生不引起GVHD。T细胞来自人类胚胎干细胞(ESC)和诱导多能性干细胞(iPSC)体外。 iPSC衍生的T细胞表达aCAR可以在体内根除肿瘤,为进一步利用自我更新干细胞的强大潜力治疗T细胞奠定基础。 iPSC技术的结合,也因此为免疫工程可以提供生成唯一结合有利属性的T细胞的机会,包括抗原特异性,缺少同种异体活性,增强的功能正常关系和组织相容性。

调节性T细胞

工程化T细胞的潜力可能超过癌症自身免疫。 CAR T细胞可以消除自身反应性B细胞,如在寻常型天疱疮的小鼠模型中所证明的,还可以利用工程化的T调节细胞来抑制免疫应答,可能对自身免疫性和移植耐受性CAR技术的应用领域进一步发展有用。

临床结果:CD19范例

在临床成功应用CAR疗法,不仅需要一个强大的CAR,而且也需要一个合适的靶标,理想的是在所有的肿瘤细胞中发现并且不存在于所有的正常细胞中,或至少重要细胞。 我们将CD19确定为潜在的目标,大多数白血病和淋巴瘤中的细胞表面表达及其在信号中的作用。如预期的那样,特别是如果是时间有限,靶向CD19诱导B细胞发育不全,是临床可控的。令我们感兴趣的是B细胞消除将阻止推出的抗CAR抗体的出现这种可能性的出现,这些抗体最终在其他CAR中被观察到。

我们对CD19 CAR的研究是第一次展示完整肿瘤根除,转染CAR T细胞的全身性淋巴瘤,对用于随后的临床研究提供基础和理由。三组报道了可能的早期造成三种不同的B细胞恶性肿瘤:弥漫性较大B细胞淋巴瘤,慢性淋巴细胞白血病(CLL)和急性淋巴细胞白血病(ALL)。这些研究集中在复发,化疗难治性患者,并利用其中之一,基于CD28或4-1BB的CAR。引人注目的是,尽管在疾病组织学,单链可变片段(scFv),载体利用和制造过程中有差异,但是特别是整体响应速度非常快均有报道,(表格1)。这些结果已经使T细胞工程和CAR T细胞成为癌症免疫治疗革命的中心,这些临床结果已经在其他地方进行了广泛的证实,他们可以说是通过细胞和基因治疗获得的最引人注目的临床成果之一。 

CAR治疗在下一个十年

细胞和基因工程技术推动了CAR治疗,基于CD19范例可以进行有效和易于治疗的细胞治疗。然而,CAR治疗尚未发挥其全部潜力。正如在这里所看到的,仍然有许多问题,如何最好地利用基因工程和细胞生物学生成最好的药物。解决细胞工程问题中有时遇到的毒性T细胞,设计如何解决实体肿瘤的广阔领域是下一个要解决的任务。 CAR对自身免疫和移植耐受也有潜在的影响。 CD19 CAR治疗比之前的任何其他细胞治疗引发了制药行业的兴趣。CAR治疗的发展可能会使所有其他细胞工程疗法受益。 T细胞工程至今不容易被接受,但它能激发新一代科学家和医生通过细胞工程寻求治疗药物。

参考文献:

Rivière I, Sadelain M.Chimeric Antigen Receptors: A Cell and Gene Therapy Perspective.Mol Ther. 2017 May 3;25(5):1117-1124.

 

 


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