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• 龙彦 孙媛媛 刘畅 马寅婷 贺春辉 许兰平 赵晓甦 赵晓涛 王辉

选自中华检验医学杂志, 2017,40(02)

人腺病毒(human Adenovirus, HAdv)是一种双链DNA病毒，绝大多数免疫功能正常者在儿童或青少年时均可能感染，常无明显症状或仅表现出轻微的临床症状，如发热、腹泻等。然而，在免疫功能低下人群如HIV感染、实质性器官移植后及异基因造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation，allo－HSCT)后患者中，HAdv可再次激活或产生新发感染，甚至发生播散性HAdv感染，引起多器官感染如肠炎、出血性膀胱炎、肝炎及肺炎等，感染率高达3.0%～21.0%^[1,2,3]，死亡率高达7.7%～38.0%^[4]，尤其在儿童患者，外周血HAdv高载量和累及多个器官时，死亡率更高。预防性抗病毒治疗或尽早开始抗病毒治疗能降低HAdv感染的临床死亡率。因此，了解allo－HSCT患者HAdv感染的临床特点，早期发现HAdv感染并及时治疗，有助于改善HAdv感染患者的预后。孙于谦等^[5]曾对在北京大学人民医院行allo－HSCT后HAdv监测阳性的HAdv感染患者进行了分析，但目前国内尚缺乏HAdv感染的大规模的临床分析数据。本研究通过对北京大学人民医院2012年10月至2014年8月allo－HSCT后患者HAdv感染情况进行分析，为有效监测HAdv感染，指导临床HAdv感染治疗提供一定的实验室依据。

对象与方法

一、对象

病例入选标准：(1)2012年10月至2014年8月在我院进行HAdv监测的allo－HSCT患者；(2)allo－HSCT后自预处理始进行每周2次外周血HAdv监测，直至100 d，临床疑似HAdv感染累及相应器官时，进行相应病灶处标本的HAdv监测，标本类型包括粪便、尿、肺泡灌洗液。100 d后进行必要时监测，包括外周血、粪便、尿、肺泡灌洗液；(3)同时进行巨细胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein－Barr virus，EBV)的定量监测；(4)随访时间为6个月及以上。本研究通过北京大学人民医院伦理审查委员会审查(批号2013－42)，所有患者均签署知情同意书。

二、方法

1．试剂与仪器：

ABI Prime 7300实时荧光定量扩增仪购自美国ABI公司；腺病毒检测试剂盒购自中山大学达安基因公司。

2．标本采集及保存要求：

外周血标本：EDTA抗凝外周血2 ml，标本采集后24 h内低速离心(1 760×g，3 min)，分离血浆。非血标本：粪便(>10 g)、尿(>3 ml)、肺泡灌洗液(>3 ml)。分离后的血浆标本3 h内完成核酸提取，外周血分离后血浆或非血标本室温放置不能超过3 h，2～8 ℃保存不能超过1周，－20 ℃保存不能超过1个月。

3．核酸提取：

外周血标本：(1)将已分离好血浆与试剂盒配套核酸提取液按50 μl：50 μl的比例震荡混匀10～15 s，室温放置10～20 min；(3)100 ℃高温裂解10 min；(4)高速低温离心14 000×g 10 min，取上清作为模板进行核酸扩增。非血标本的核酸提取：粪便标本：(1)取2～3 g粪便加适量生理盐水1.0～1.5 ml于1.5 ml离心管中充分混匀洗脱，低速离心(1 760×g，3 min)去沉淀留取上清高速离心(14 000×g，5 min)；若为水状便，则直接取1～1.5 ml置离心管高速离心14 000×g 5 min。(2)高速离心后去上清，留取沉淀，再按外周血核酸提取操作步骤(2)～(4)。尿或肺泡灌洗液；直接取标本1～1.5 ml高速离心(14 000×g, 5 min)，去上清，留取沉淀，按外周血核酸提取操作步骤(2)～(4)。

4．PCR反应扩增：

按照试剂说明书比例(HAdv PCR反应液38 μl/人份＋Taq酶3 μl/人份)配置反应体系，充分混匀后按41 μl/管分至0.2 ml PCR反应管中，然后将提取好的核酸模板上清液、质控品(阴性、弱阳性和强阳性质控)、标准品(S1：2×10⁷、S2：2×10⁶、S3：2×10⁵、S4：2×10⁴)4 μl分别加入配置好的反应体系中，瞬时离心10～15 s混匀，同时将4 μl，加盖密封备用。反应条件：93 ℃ 120 s，93 ℃ 45 s，55 ℃ 60 s，10个循环，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，30个循环；选择检测通道为FAM通道。如果扩增曲线不呈S型曲线或循环阈值(cycle threshold，Ct)值＝30，则样本检测值小于检测极限，如果扩增曲线呈S型曲线且Ct值<30，则由标准品绘制的标准曲线，得出相应的定量检测值。同时阴性、弱阳性及强阳性质控均应在控。

5．allo－HSCT方案：

详见文献[5]。

6．HAdv感染相关临床疾病定义^[6]：

系统性HAdv感染/HAdv血症：应用PCR技术或抗原检测、病毒分离等方法从患者外周血中检出HAdv核酸阳性。局部感染：应用PCR技术或抗原检测、病毒分离等方法从活检组织或体液等中(不包括外周血)检出HAdv核酸阳性。临床诊断HAdv病：HAdv阳性同时伴有相应的临床症状，但无组织病理学证实。确诊HAdv病：HAdv阳性同时伴有相应的临床症状，组织病理学证实HAdv阳性。

结果

一、病例特点

本研究共入选allo－HSCT患者845例，其中男性和女性分别为448和397例，中位年龄为31(1～63)岁，儿童和成人分别为155和690例。同胞相合患者共280例，单倍体相合移植患者共545例，非血缘移植20例。在845例入选人群中，以急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病及骨髓增生异常综合征最多，分别为349、272和112例，其次为慢性髓系白血病、再生障碍性贫血、多发性骨髓瘤及非霍奇金淋巴瘤。

二、HAdv实验室阳性检出率情况分析

本研究共检出HAdv阳性29例，其中男19例、女10例，中位年龄为25(3～57)岁。单倍体相合移植患者共28例，同胞相合1例。在845例入选人群中，急性髓系白血病、急性淋巴细胞白血病及骨髓增生异常综合征，分别为10、10和6例，其他3例分别为非霍奇金淋巴瘤再生障碍性贫血和多发性骨髓瘤；共25例患者在allo－HSCT后发生急性移植物抗宿主病(graft－versus－host disease，GVHD)[(86.2%，25/29)急性GVHD Ⅰ～Ⅱ°14例、急性GVHD Ⅲ～Ⅳ°11例]，4例发生慢性GVHD(13.8%, 4/29)。

HAdv检测阳性率为3.4%(29/845)，儿童(<18岁)阳性率为3.8%(6/155)，成人(≥18岁)阳性率为3.3%(23/690)。allo－HSCT后在100 d内HAdv检出阳性占总阳性例数的72.4%(21/29)。其中外周血HAdv阳性共19例，尿HAdv阳性9例，粪便阳性16例，肺泡灌洗液阳性1例，外周血＋粪便HAdv阳性7例，外周血＋尿HAdv阳性5例，外周血＋肺泡灌洗液HAdv阳性1例，其中外周血＋粪便＋尿HAdv阳性1例。HAdv检出阳性的中位时间为69(13～189)d；外周血检出阳性的中位时间为85(40～102)d；粪便为56(53～144)d；尿为51(28～81)d。

三、临床HAdv感染合并其他病毒感染情况分析

HAdv检测阳性人群中，17例合并CMV血症(58.6%，17/29)，CMV血症发生的中位时间为30(11～135)d，11例合并EBV血症(37.9%，11/29)，EBV血症发生的中位时间为43(34～163)d，CMV血症和EBV血症发生的中位时间均早于HAdv。25例HAdv检测阳性前均发生了GVHD，其中累及皮肤18例，肠道16例，肝脏2例，4例发生了GVHD。

四、HAdv临床诊断及转归

结合HAdv检测结果和临床资料显示，有5例诊断为HAdv血症(外周血HAdv阳性)；14例诊断HAdv肠炎(腹泻且粪便HAdv阳性)，其中5例为HAdv血症＋肠炎，7例诊断为出血性膀胱炎(血尿且尿HAdv阳性)，其中3例合并HAdv血症＋出血性膀胱炎，2例诊断为HAdv血症＋肠炎＋出血性膀胱炎＋肝炎(肝功能急剧恶化，除外GVHD及药物性肝损害)，1例为HAdv血症＋肺炎，见表1和图1。8例患者给予西多福韦(每周5 mg/kg)治疗，6例经西多福韦治疗后HAdv转阴，2例经西多福韦治疗无效，见表2。

图1

1例HAdv血症＋肠炎＋出血性膀胱炎＋肝炎经西多福韦治疗无效死亡患者肝功能变化

讨论

病毒感染是allo－HSCT后患者常见的严重并发症之一，临床常见病毒有CMV、EBV等。近年来，HAdv的感染率逐年增加，导致患者感染的危险因素主要包括：儿童(<18岁)、去T细胞移植、合并GVHD、单倍体相合移植、脐带血移植、抗胸腺球蛋白(anti－thymoeyte globulin, ATG)治疗及外周血淋巴细胞计数<0.2×10⁹/L等^[4]。国外文献报道allo－HSCT后患者HAdv感染率高达3.0%～21%^[4,7]，儿童感染率为6%～42%^[8]，成人3%～15%^[1,9]。本研究中HAdv感染率为3.4%(29/845)，儿童HAdv感染率为3.8%(6/155)，高于成人3.3%(23/690)，与国外文献报道较为一致，但二者感染率均低于国外报道。分析原因可能为：首先，本研究人群中未纳入脐带血移植患者，均未采用体外去T细胞移植模式。而国外较常采用体外去T细胞移植和脐带血移植，二者均是发生HAdv感染的高危因素。其次，本研究对allo－HSCT后患者外周血、粪便、尿及肺泡灌洗液进行监测，未进行咽拭子、肠黏膜组织等标本检测。另外，本研究患者常规监测至allo－HSCT后100 d，但部分患者在100 d后，由于当地尚未开展HAdv检测，故未能在必要时继续监测，致使这部分患者100 d后发生的HAdv感染未能发现，以上均使得国外文献报道的HAdv感染率较高，此外，本研究感染率高于孙于谦等^[5]报道的单倍体移植后100 d ADV血症累积发生率为1.1%，分析主要有两方面的原因：首先，入选人群的差异，本研究除研究在我院行allo－HCST的患者外，尚包括在外院行allo－HSCT后，由于病情较重转入我院进行监测治疗的患者，此部分患者是病毒感染包括HAdv感染的高危人群；此外，孙于谦等^[5]分析移植后100 d ADV血症累积发生率，本研究尚对非血标本HAdv监测阳性的患者同时进行分析，同时与临床医生对HAdv感染的警惕性有很大提高，重视对allo－HSCT患者的HAdv监测有关。HAdv感染在儿童患者中更易发生，且发生的时间更早，预后更差，原因可能为儿童尚未建立针对各种血清型HAdv的有效免疫防御机制。此外，本研究HAdv阳性患者中82.7%(24/29)合并GVHD，其中20例合并GVHD，4例合并GVHD，因此，对于儿童患者、合并GVHD人群，应重视HAdv的监测。同时对于单倍体移植人群，在临床高度怀疑HAdv感染时，应及时进行HAdv检测，目前已纳入欧洲白血病感染会议的推荐^[6]。

HAdv感染一般发生在allo－HSCT后2～3个月(100 d)内，可累及全身多个脏器，表现为肠炎、出血性膀胱炎、肺炎、肝炎、胰腺炎，甚至脑炎、肾炎等。本研究人群中，临床表现以肠炎48.3%(14/29)和出血性膀胱炎24.1%(7/29)最为常见，2例累及多个脏器，临床诊断为HAdv血症＋肠炎＋出血性膀胱炎＋肝炎，1例患者诊断为HAdv血症＋肺炎。大部分患者经抗病毒治疗后，HAdv转阴，但仍有部分患者即使应用西多福韦治疗后，仍未能控制病情，共8例临床死亡，病死率为27.6%(8/29)，国外文献报道为7.7%～38.0%^[4,10],依据检测结果和临床资料，可能有以下原因导致患者预后差：首先，此8例患者外周血HAdv定量值均>1 000拷贝数/ml，最高达10⁸拷贝数/ml；其次，8例患者中，有6例在allo－HSCT后100 d内发生HAdv感染，仅2例发生在100 d后(分别为183 d，131 d)，HAdv感染发生愈早，患者预后愈差，国外文献报道allo－HSCT后100 d内发生HAdv感染，致命性、播散性HAdv感染的发生率>60%^[11,12]。再次，累及多个器官(>2个)或累及肺和肝脏时，预后差、死亡率高，国外文献报道高达83%^[13]。本研究中2例累及多个器官(>2个)患者和1例累及肺部的患者在随访期内临床死亡。最后，合并其他病毒感染亦是导致患者预后差的原因，其中8例患者均合并CMV感染，5例合并EBV感染。

在本研究入选人群中，有2例患者合并HAdv肝炎，HAdv肝炎临床表现非特异，在HAdv感染累及肝脏2周左右后方可出现肝功能异常，预防性或早期使用西多福韦能使部分患者HAdv转阴，故早期诊断对临床意义重大。本研究中2例患者经影像学检查除外如药物性肝损害等^[11]，临床诊断为HAdv肝炎，在肝功能异常指标中，转肽酶升高较AST和ALT均较早且升高幅度更大，此前已有类似文献报道^[12,13]，因此，当临床外周血HAdv阳性同时有肝功能异常时，经影像学检查排除GVHD和药物性肝损伤时，转肽酶升高对HAdv肝炎的早期诊断具有预警作用，提示临床可尽早使用西多福韦进行抗病毒治疗，从而改善患者预后，但本研究中HAdv肝炎患者例数尚少，有待进一步扩大样本量进行验证。

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