巧用基因突变，阻断信号通路
我们研究一个基因的功能，通常如何下手呢？一般的步骤是：
1.过表达该基因可导致下游某些信号增强或减弱；或给予特定的刺激，该基因表达的蛋白表达量发生变化；
2.Knockout或Knockdown该基因，下游信号反向改变；或再给与刺激，功能消失；
3.Rescue或重新Overexpression该蛋白，功能恢复。
第二步Knockout是很重要的一步，今天就给大家介绍“Dominant negtive技术”，它不仅可以完成前面提到的knockout，更加能在缺乏抑制剂的时候，挺身而出进行信号通路的阻断，帮我们完成实验。
“Dominant negtive技术到底是什么，感觉好神奇！”别急嘛，下面我们就从Dominant negtive技术的基本原理开始慢慢给小伙伴们梳理一下，并将其引入最终应用！
Dominant negtive（显性负效应），这个概念我们可以追溯遗传学的显性突变：一个基因的两个等位基因中，有一个等位基因发生突变就能产生异常的生物学效应，那么这种突变称之为显性的（dominant），常染色体显性遗传病的基础一般都是显性突变。
Dominant negtive概括来说即为：如果细胞内的一对等位基因，当一个位点的基因发生突变而对应等位基因为野生型时，那么突变基因将导致另一个wild type的等位基因功能丧失。
具体原理主要有两种情况：
1. 突变基因翻译出来的突变蛋白与wild type蛋白结合（或者称之为直接作用），使wild type蛋白功能丧失，这种结合不一定是1：1，也有可能是1：2或者2：1或者其他比例，视蛋白的结构功能而定，如下图所示：
2. 突变蛋白的突变位点在功能位点，而其结合位点依然正常，导致其与wild type蛋白竞争性的结合底物，导致wild type的功能受阻，如下图所示：
随着细胞内Dominant negative现象被人们发现，大家逐渐将其引入到实验中，即在细胞中表达目的蛋白的dominant negative variant，使其干扰目的蛋白的功能，但本身其翻译产物是无功能的，所以可以起到类似抑制剂的作用。在一些信号通路的研究中，由于缺乏特异的抑制剂，所以需要应用这样的基因variant，将其转染入细胞起到阻断作用。接下来，上实例！
实例一：这篇文章主要阐述的问题是，CD36通过激活细胞中的PPARγ来抑制HSP70的表达。已经有文献报道过CD36能与OxLDL结合，从而抑制HSP70的表达，作者构建了突变的CD36—CD36ΔN （去除CD36 N末端区域），CD36ΔC （去掉CD36 C末端区域），CD36ΔN/C（去除CD36全部包浆区域），突变的CD36能与野生型CD36竞争性结合OxLDS，从而抑制wild type CD36的功能，进而提升下游HSP70的表达（如下图所示）。
接下来作者又用siRNA验证了这个方法，用siRNA knockdown CD36后发现，HSP70表达升高，说明wild type CD36功能受阻，证明CD36突变体确实可以导致wild type CD36失去活性。
实例二：这篇文章主要讲PI3K/AKT通路促进Mdm2从细胞质移位到核内。作者将PI3K的dominant negative variant—△p85，AKT的dominant negative variant KD-Akt转入细胞内，它们均可导致wild type PI3K和wild type AKT发生功能抑制，从图中可以看出，△p85和KD-Akt的表达抑制了Mdm2的入核，说明当PI3K和AKT的功能受阻后，Mdm2将不能入核，间接证明了PI3K/AKT能促进细胞入核。
红色：Mdm2
绿色：细胞核
这个技术也可以得到延伸，比如我们只想阻断一个定位于细胞核的蛋白的功能，但是其他的细胞器上也有这个蛋白，我们就不能，用siRNA干扰的方法，但我们却可以使用dominant negative技术，在dominant negative上去掉非细胞核附着部分，只保留NLS（核定位信号），这样就可以干扰掉定位于细胞核的目的蛋白。
从上述介绍中可以看出，dominant negative技术类似于siRNA干扰技术，均可以产生某一蛋白knockdown的结果，想要使某一基因knockdown，主要有三总方法： 1)siRNA; 2)dominant negtive; 3)specific inhibitor，但当缺少某一种蛋白特异的抑制剂时，我们即可采取dominant negtive和siRNA技术。
另外dominant negative也可以用作knock out，我们再反过来看实例一中的图，可以看到不同突变体对wild type CD36的抑制能力均不相同，如果已经知道某一突变体对其wild type的抑制能力很强，那么可以通过过表达这个突变体来达到knock out wild type蛋白的目的。
Knockout对研究基因可是很重要的一步，以前大多数采用基因双交换的方法将该基因替换为某些报告基因（比如抗性基因），使得该基因敲除，但是操作繁琐，而且如果敲掉的基因内部存在调控其它基因的元件则必须再做互补试验，证明本篇文章讨论的这个现象并不是由于内部的调控元件所导致；
因此dominant negative也是一种可以考虑的knockout和knockdown的补充方法，但这种方法虽然已经应用了很长时间，但是没有被广泛应用，究其原因，可能由于大多数基因并不具有天然的dominant negative的形式，如果去筛选突变将是很大的工作量。不过好消息是，我们经常遇到的一些基因已经明确报道过有dominant negative的形式，如STAT3，p53，CD36，PI3K，AKT等（可都是明星分子啊！），因此当我们在研究这些基因时，可以考虑用这种方式，使我们的数据更加丰富。
