CRISPR/Cas9基因编辑张峰大神又发新作啦！
把发NATURE当做家常便饭的CRISPR/Cas9基因编辑张峰大神又发新作啦！我们还在为发3-5分的文章发愁，愁，愁...
来，先膜拜大神新作讲了个啥，看看我们能蹭蹭车，做些啥。
首先，摘要：
简单的来说，就是：
大神在2016年发现C2C2（现在叫做Cas13a），这一RNA导向的RNA酶，在细菌中验证其可以特异性下调mRNA表达量。C2C2蛋白的切割功能是由两个存在于高等真核生物中的催化残基和原核生物核酸结合功能域组成的。2016年只是发现了它是RNA导向的RNA酶，并未在哺乳动物中实现功能验证，而本文《RNA targeting with CRISPR-Cas13》则简明扼要地说明了大神成功地将这一RNA编辑工具应用到了哺乳动物细胞中。
具体做了哪些呢？我们来看看：
首先要找高活性的LwaCas13a蛋白实现酶切功能，毕竟酶就是蛋白质嘛~
其次，试验采用具有28碱基的 spacer序列的导向RNA验证了LwaCas13a蛋白的体外切割活性。当导向RNA的spacer长度截短至20nt的时候，蛋白-RNA复合体仍然具有体外切割活性，当spacer长度小于20nt的时候，蛋白-RNA复合体就只能结合到RNA上面但是不能切割啦~
哺乳细胞中搞事情！！！！
对LwaCas13a蛋白进行密码子优化后将其序列克隆进真和表达载体中并与msfGFP融合表达，蛋白的N端或者C端加有核定位信号(NLS)或者蛋白外泌信号(NES)。
同时构建了双荧光素酶报告载体：其中一个荧光素酶转录本作为靶序列，另外一个作为对照；
当在293T细胞中靶向Gaussia荧光素酶基因的转录本中两个靶点时，效率如下：
靶点1 靶点2
传统shRNA干扰技术 78.3% 51.5%
LwaCas13a靶向效率 75.7% 72.9%
导向RNA中spacer长度为28nt的时候打靶效率最高，且打靶效率是剂量依赖型，也就是，转染的时候，加的质粒越多，打靶效率越高哦。
接下来，作者对293T细胞中三个内源基因KRAS, CXCR4, 和 PPIB进行下调试验。对于KRAS和CXCR4位点，下调效率(CXCR4 83.9%, KRAS 57.5%)和用shRNA干扰效率(CXCR4 73.9%, KRAS 44.3%)很接近；在A375黑色素瘤细胞系中也得到了相似的结果。
不仅在细胞系上进行了基因下调试验，在水稻上的结果表明该新兴LwaCas13a对RNA的靶向效率与传统的shRNA干扰效率几乎一致。
利用U6启动子成功地进行多位点同时干扰，其中导向RNA为28nt，重复序列长度为36nt，”M”代表转入多个阵列，可以看出多位点同时干扰是有效果的。
同时靶向多基因时，串联的导向RNA中缺失哪个，就只有那个靶位点的干扰受影响，其余位点不受影。
转录组mRNA测序差异表达分析表明用shRNA干扰的脱靶率很高，而采用LwaCas13a干扰则几乎没有产生脱靶。并且LwaCas13a干扰不会在转录组水平产生细胞的应激反应。
怎么样？是不是大致了解了这个新兴RNAi工具呢？那么快快开始应用到自己的试验中吧~~~~祝大家赶紧抱紧大神大腿，扩展该RNAi工具，发文章哦~~~
