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        前面我们已经介绍了如何选择标本进行肿瘤基因检测，那么接下来的问题是，通过什么样的基因检测手段才能获得我们想要的信息？基因检测的方法多种多样，原理及操作也各不相同，只有在充分了解各方法的基础上，才能选择合理的基因检测项目。其中实时荧光定量PCR（简称qPCR）及测序的方法被临床实践普遍采用，下面一一介绍。

qPCR法主要包括探针法和染料法，其中探针法特异性较高，临床应用广泛。以ARMS-qPCR法为例，该方法主要采用了TaqMan探针，多应用于已知突变位点的检测，可检出的变异形式包括点突变及小片段的插入或缺失。该方法的关键原理是引物3’端碱基与模板不互补时，DNA聚合酶无法延伸；反之，DNA聚合酶延伸，在其5’→3’外切酶活性的作用下，TaqMan探针降解成小片段发出荧光，对荧光累积信号进行监测获得模板信息。ARMS法具有高度的特异性，可检测出0.5%的突变率，操作简单，检测时间仅需几个小时。

ARMS-qPCR原理图

以BRAF基因突变检测为例。在恶性黑色素瘤、甲状腺癌及结直肠癌等多种人类恶性肿瘤中均存在不同比例的BRAF突变，其中c.1799T>A V600E是最主要的突变类型，占约60%~100%。我们中心开展的BRAF基因V600E突变检测项目采用ARMS-qPCR法，能够检测出肿瘤组织中BRAF基因是否发生V600E突变。如果我们同时还需要一次性获得更多突变信息，就需要采用其他方法，比如接下来介绍的测序方法。

自1977年F. Sanger等人建立一代测序方法以来，测序技术突飞猛进，目前已发展到第四代测序。然而，应用到临床的测序技术主要是一代测序和二代测序。

        一代测序，如常用的Sanger法测序，其核心原理为双脱氧链终止法。每个反应含有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)使之扩增，并混入带不同荧光标记的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)，由于ddNTP缺乏延伸所需要的3’-OH基团，DNA链的延伸就此终止，得到一系列起始位置相同、以ddNTP结尾的长短不一的DNA片段，长度相邻的片段只相差一个碱基。通过毛细管电泳将DNA片段分离开来，并根据ddNTP上的荧光信号来识别碱基获得序列信息。Sanger法结果准确，读长较长（约1000碱基），目前依然是测序的金标准，但其检测的灵敏度较低（~10%），通量小，成本高，检测时间需1-2天。与ARMS法不同，Sanger法测序可检测出多个已知或未知点突变及小片段的插入或缺失。

双脱氧链终止示意图

继续以BRAF基因突变检测为例，我们中心开展的BRAF基因测序检测项目采用一代测序法，针对15号外显子热点突变位点，除了得到V600E突变情况以外，我们还可了解是否发生V600D及V600K的突变。进一步，当我们需要得到更多基因序列信息或者单个基因（如BRCA1/2基因）太长时，一代测序的方法会非常耗时且繁琐，这时我们就需要更高通量的测序方法—二代测序。

二代测序现有的技术平台主要包括Ion torrent和Illumina，各个平台的检测原理不同且较复杂，简而言之就是，可一次性快速获得很多的序列信息。除了点突变及小片段的插入或缺失外，二代测序可检测的变异形式还包括基因扩增或融合/重排等，检测变异的敏感度亦达1%。由于其优势明显，二代测序方法已被广泛用于肿瘤基因靶向测序、全外显子组测序等，但相较于一代测序，二代测序在数据注释及解读的要求都比较高，检测时间也较长。

我们中心目前已开展多个二代测序项目，主要围绕肿瘤基因组信息的挖掘。如甲状腺癌相关18基因项目除检测BRAF基因外，还包括其他17个与甲状腺癌发生及良恶性判断密切相关的基因，方便我们对疾病有更全面的了解，指导临床治疗。

     由此，我们可以看出，ARMS-qPCR、一代测序及二代测序各有优劣，获得的信息量也大不相同。根据临床的需求进行选择，ARMS-qPCR法主要用于特定基因已知热点突变的检测，如EGFR基因21种突变检测等；一代测序主要用于单个基因的测序及基因多态性分析，如HLA复合基因的序列测定，也常应用于二代测序得到的变异位点的验证及家属验证；二代测序则应用于多基因靶向测序、全外显子组测序等。

ARMS-qPCR法与测序法的比较

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作者单位：中山大学孙逸仙纪念医院细胞分子诊断中心

责任编辑：廖健伟、温晓君

审核：欧阳能太、李晓娟