基因治疗杜氏肌营养不良的进展
基因治疗杜氏肌营养不良的进展
美国肌营养不良家长项目PPMD2月22日举办了基因治疗论坛，美国食品药品管理局、制药企业、患者和患者家庭共聚一堂，探讨基因治疗杜氏肌营养不良的新进展。
会议讨论的主要焦点是，目前基因治疗杜氏肌营养不良研究技术的新进展
主要有以下4个话题
1、通过腺相关病毒作为基因载体，将外源的基因送入细胞。
2、截短抗肌萎缩蛋白基因，让其装入腺相关病毒。
3、移植非抗肌萎缩蛋白基因的其它基因，治疗杜氏肌营养不良。
4、基因治疗脊髓性肌肉萎缩SMA。
1、关于腺相关病毒基因载体的问题，首先发言的是宾夕法尼亚州立大学的JimWilson。他谈到基因治疗最初使用的是腺病毒，但是腺病毒有很强的炎症性，会引起很强的免疫应答。尽管进行基因移植后，产生了大量的蛋白，但是因为有很强的免疫应答，治疗效果很快丧失。于是研究者开始使用腺相关病毒。该病毒长期潜伏在人体内，很少表现出炎症，而且能够稳定地表达，理论上该病毒装载外源的基因，进入细胞后可以稳定地表达好几年。
他首先研究的是腺相关病毒2，发现可以进入细胞，没有出现免疫应答，持续表达了11年。他目前研究的是腺相关病毒8和9，引起免疫应答的可能更小，而且能够进入特定的组织，如心脏和骨骼肌。目前世界首个已经上市的基因药物Glybera，该药物是用于治疗脂蛋白脂肪酶缺失Lipoprotein Lipase Deficiency，使用的基因载体就是在他的实验室开发的。
对于基因移植治疗杜氏肌营养不良，目前还有一些问题需要克服。一是怎样将装载外源抗肌萎缩蛋白基因的腺相关病毒载体送入患者的肌肉细胞。目前在实验狗和实验猴的研究中，腺相关病毒9有能力穿越血管壁进入肌肉，目前的研究还在继续。二是治疗的安全性问题，腺相关病毒造成的免疫应答还是存在，因为杜氏肌营养不良是一种炎性的疾病，很容易引起免疫应答，研究者，讨论了使用免疫抑制剂的问题，例如使用激素等。三是腺相关病毒供应的问题，对杜氏肌营养不良患者，进行系统的基因移植治疗，每位患者需要20升的腺相关病毒，需要有足够量的腺相关病毒的提供。目前有些公司已经在考虑这个问题，为未来两年的小规模的患者的临床实验做准备。
2、在会上华裔基因治疗专家段东升介绍了他的研究情况。腺相关病毒的容量是5000个碱基，而抗肌萎缩蛋白有13000多个碱基，所以无法全部装入。为了解决这个问题研究者将抗肌萎缩蛋白基因截短，同时又让基因保持一定的功能。目前最小的抗肌萎缩蛋白基因删除了17到48号外显子，它的容量是6000个碱基，还是略大了一点。段东升教授和其他的研究者努力的寻找，抗肌萎缩蛋白基因上，哪些片段可以去除，同时又能最大限度地保持功能。他们制作的微型抗肌萎缩蛋白基因可以少于5000个碱基。他们将腺相关病毒装载的微型抗肌萎缩蛋白基因，通过血管系统的注入实验鼠和实验狗体内，都发现外源的抗肌萎缩蛋白，在动物骨骼肌和心肌中的良好表达。在实验鼠的肌肉活检中，肌肉的组织病理戏剧性的降低，肌肉力量得到增强。在实验狗的大肌肉群和小肌肉群包括心肌中，都观察到了抗肌萎缩蛋白的良好表达，纤维化和疤痕组织减少。基因治疗一次注射，使用5个星期的免疫抑制药，治疗效果长达9个月。这些有希望的研究结果显示了，微型的抗肌萎缩蛋白基因，在基因治疗中，能够有效的产生有功能的抗肌萎缩蛋白。
3、移植非抗肌萎缩蛋白基因以外的其他基因治疗杜氏肌营养不良
国立儿童医院的教授Kevin Flanigan讲了两种非抗肌萎缩蛋白基因的移植，对治疗杜氏肌营养不良有帮助。这些方法不能修复抗肌萎缩蛋白基因本身，但是可以增强对肌肉健康有帮助的其它蛋白的表达。一个是GALGT2蛋白基因，另一个是造成永久性外显子跳跃。
GALGT2蛋白在sarco聚糖综合体中存在，与utrophin蛋白调高有关。该蛋白在我们人体内自然存在，所以不太会产生免疫应答。目前由腺相关病毒介导的该基因的移植方法，正在准备对人类杜氏肌营养不良患者，开展临床试验。另外，这个蛋白表达的增加对治疗其他肌营养不良也有帮助。
另一个非抗肌萎缩蛋白基因移植的方法是，用腺相关病毒装入一个U7snRNA (U7小核RNA)，U7snRNA包含着一个外显子跳跃的命令，递送到患者的肌肉细胞。这一方法已经成功的对2号外显子重复的杜氏肌营养不良实验鼠进行了实验。由于是拿掉了两个2号外显子当中的一个，所以留下的是全长的抗肌萎缩蛋白基因。研究显示这项治疗方法，在实验鼠肌肉细胞膜上正确的位置，产生了有功能的抗肌萎缩蛋白的表达。这方法可以对重复突变造成的杜氏肌营养不良患者的外显子跳跃策略，提供参考的依据。
用这种2号外显示重复的实验鼠，KevinFlanigan教授所在的实验室还发现了抗肌萎缩蛋白基因的一种新特点。研究者发现，在抗肌萎缩蛋白基因5号外显子的内部，有一个内部核糖体进入位点internalribosomal entry site (IRES)。当这一位点被启动，就会产生截短的有功能的抗肌萎缩蛋白。KevinFlanigan教授所领导的研究团队，已经开始研究抗肌萎缩蛋白基因上5号以前外显子发生突变，是否能够采用这种方法重新启动合成抗肌萎缩蛋白的过程，恢复截短的有功能的抗肌萎缩蛋白的表达。
