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来源：探肝

研究背景

        肝细胞癌（Hepatocellular carcinoma ,HCC）已成为癌症相关死亡的主要原因。其死亡率在西方人群中有所增加，少数患者在早期阶段被诊断出来，该阶段患者可进行治愈性治疗。在过去的十多年里，研究者对HCC分子发病机制的认识有了显著提高。大量样本的高通量测序分析的累积数据为HCC基因突变情况提供了准确的全景分析。这使得研究者能够描述一些可能主导肿瘤发生发展的关键事件，并有望将这些知识转化为新的靶标和生物标志物，从而可能影响肝癌的治疗决策，并最终改善患者的治疗效果。然而，今后还会面临一些挑战：（1）HCC最普遍的致癌突变目前是无药可用的；（2）在可以确定HCC的分子亚型或明显驱动通路的情况下，将这些知识转化为临床试验的努力仍很少；（3）关于肿瘤异质性的作用及其在肿瘤晚期评估的争论，引发了人们对基于单个样本活检分层治疗未来的一些怀疑；（4）通过免疫系统治疗肝癌很有潜力，但仍有待评估。该综述概述了 HCC 发生发展所涉及的基因改变，并讨论在根据患者的预后和对治疗的反应下分子标志物在患者分层中的作用。

综述框架

Key Points 摘选

1. 在HCC中，每个肿瘤编码区的平均突变数为35~80，其中估计可能有4~8个致癌基因成瘾的驱动因子。

2. HCC的遗传易感性：APC 胚系突变、引发罕见遗传代谢疾病的基因突变；与危险因素（如病毒性肝炎，酒精摄入或肥胖）、慢性肝病的严重程度及其向肝硬化演变或恶性转化和肿瘤进展相关的一些SNPs。

3. 肝硬化恶性转化过程：肝硬化→低度异常增生结节（LGDN）→高度异常增生结节（HGDN）→早期HCC →进展性HCC和晚期HCC；其恶性转化与TERT的胚系和体系突变相关。

4. 肝细胞腺瘤的恶性转化过程：在正常肝细胞中具有转化风险的单克隆良性增殖，β-连环蛋白激活突变提高恶性的转化风险，最后TERT启动子突变同时伴随全基因组低甲基化和染色体畸变的增加。

5. 肝癌发生过程中涉及的驱动通路：端粒维持、WNT/β-连环蛋白信号通路、P53细胞周期信号通路、表观遗传修饰、氧化应激信号通路、PI3K / AKT / MTOR和RAS / RAF /MAPK信号通路。

6. HCC大致可分为2个主要分子亚型：（1）增殖类亚型，特征是富集与细胞周期中细胞增殖和进展相关的信号，并且通常与更具攻击性的表型相关；（2）非增殖类亚型，通常保留类似于正常肝脏生理学的分子特征。

7. 基于对癌旁和肿瘤组织基因数据的分析，加上临床表征数据，研究者开发了多种预后预测模型；在HCC的治疗方面，可针对靶向信号级联或免疫检查点、针对癌基因成瘾通路使用相关的生物标志。

1.1  HCC易感基因与环境的相互作用

       肝癌的发生是基因和非基因的宿主因素之间复杂的相互作用、接触环境致癌物、病毒以及潜在慢性肝病的发展造成的，而在其最终阶段 (即肝硬化)， HCC的发生将成为特定的癌原场。虽然肝硬化是大多数肝癌生长的 "土壤"，但HCC在非肝硬化肝上的发展有助于我们重新评估导致HCC发育而不造成背景肝损害的危险因素和机制 (图 1)。

图1  遗传易感性、环境因素和HCC发生之间的相互作用

（红色：孟德尔遗传模式；蓝色：参与HCC发生的多态性；绿色：HCC遗传印记的基因毒性暴露；紫色：用于降低HCC发病率的潜在疗法）

1.2  HCC的孟德尔遗传易感性

(1) 易患乳腺癌、卵巢癌或结直肠癌的最常见的单基因综合征通常与肝脏肿瘤的发展无关。

(2) 在特殊情况下，HCC可在APC胚系突变患者中发生。

(3) 在几种遗传代谢疾病中观察到HCC基因易感性，主要是通过肝硬化发展而来。这些遗传代谢单基因疾病包括铁或铜超载（分别是HFE1和ATP7B基因相关的血色沉着病和Wilson病）、Ⅰ 型酪氨酸血症（与FAH基因相关）、急性间歇性卟啉症（与HMBS基因相关）或迟发性皮肤病（与UROD基因相关），以及α1抗胰蛋白酶缺乏症（与SERPINA1基因相关）。 此外，葡萄糖代谢的遗传改变导致糖原贮积病（与G6PC基因相关）或特定成熟型糖尿病 Ⅲ 型（与MODY3、HNF1A基因相关）可促进遗传性肝脏腺瘤病的发生，它们进一步的罕见恶性转化为无肝硬化的HCC。

1.3  肝细胞癌的多因素遗传易感性

       一些SNP（单核苷酸多态性）被确定为与HCC风险有关。SNP调节疾病在不同阶段的HCC风险，包括危险因素（如病毒性肝炎，酒精摄入或肥胖）的易感性、慢性肝病的严重程度及其向肝硬化的演变，或恶性转化和肿瘤进展。SNPs可用于对患者进行个性化监测措施的分层，并作为化学预防策略的候选目标。例如，位于EGF基因启动子区域的rs4444903多态性与HCV-HCC（丙型肝炎病毒相关性肝硬化发展而来的肝细胞癌）相关。迄今为止，没有药物（包括索拉非尼）能够降低高风险患者的HCC发病率，或者在治愈性治疗后预防肿瘤复发。

       与慢性肝病型HCC发展相关的大多数单核苷酸多态性与特定的风险因素有关。AFB1（黄曲霉毒素B1）、HBV（乙型肝炎病毒）与GTSM1/GSTT1的SNP之间的关联是在特定接触遗传毒性污染物与病毒感染和常见基因多态性之间的强相互作用而大幅增加肝癌风险的原型。

       PNPLA3多态性（编码介导三酰基甘油水解的脂肪酶）与脂肪和酒精性慢性肝病密切相关，其多态性在HCV-HCC风险中似乎只有轻微的贡献。

       GWAS（全基因组关联研究）确定了日本HCV患者与MICA（参与免疫调节的基因）的多态性相关、DEPDC5（未知功能的基因）多态性与HCC发展相关的。在4项不同的含有HBV感染中国患者的研究中，在STAT4（炎症途径中的关键蛋白）、TPTE2（PTEN的同源物）、DCL1（与HCC发病机制有关的抑癌基因）和UBEB4、KIF1B、PGD基因区域中鉴定出SNPs与HCC发生有关。

2.1 肝硬化作为HCC的癌原场

       肝硬化恶性转化是一个多步骤过程，包括：肝硬化→低度异常增生结节（LGDN）→高度异常增生结节（HGDN）→早期HCC →进展性HCC和晚期HCC。 端粒和端粒酶在肝硬化发病机制和肿瘤发生中的起关键作用。端粒是重复的DNA序列，是保护它们所在的染色体末端所必需的。它们在细胞分裂过程中缩短，导致细胞衰老和细胞凋亡。端粒酶主要包括催化组分端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse transcriptase，TERT)和端粒酶 RNA 组分(Telomerase RNA component，TERC），二者与其他端粒酶复合体亚基共同组装成具有延伸端粒末端功能的全酶，在细胞衰老和肿瘤发生过程中发挥关键的作用。在人肝脏中，端粒酶不在成熟肝细胞中表达，肝硬化组织表现出端粒缩短并伴有复制性衰老和胚系TERT突变。胚系TERT突变预计会降低端粒酶活性，与肝硬化的高风险相关。

       体系TERT启动子突变（54％~60％）、TERT扩增（5％~6％）或TERT启动子中的HBV插入（10％~15％）导致人类的端粒酶在> 90％的HCC中被重新激活（图2）。在6% 的 LGDN 和19% 的 HGDN 中，癌前病变表现出TERT 启动子突变。TERT启动子突变的频率在61％早期HCC中显着增加，并且在进展的和晚期HCC中保持稳定。此外，早期HCC和癌前病变的全外显子组测序显示，在经典HCC驱动基因中没有额外的复发突变。 这些结果表明，TERT启动子突变是最早的复发性体系基因突变。它还表明，与携带更多癌症基因突变的进展期HCC相比，早期HCC是单克隆的，其在基因组上更接近携带TERT启动子突变的LGDN和HGDN。研究一致认为，这些病变之间存在表型接近，这往往使 HGDN 和早期HCC之间的病理区分成为一项艰巨的任务，即使在肝脏病理学专家之间也是如此。这表明，在其他癌症基因的额外打击下，携带TERT启动子突变的早期HCC、LGDN和HGDN具有全面恶性转化/进展成为晚期HCC的高风险。

图2 HCC恶变的机制

2.2 肝细胞腺瘤的恶性转化

       在正常肝脏中，HCC有时可能来自肝细胞腺瘤的恶性转化，肝细胞的罕见单克隆良性增殖通常在服用口服避孕药的年轻女性中观察到。根据编码β-连环蛋白（β-catenin）的HNF1A、CTNNB1或激活炎症通路的基因（如IL6ST，FRK，STAT3，JAK1和GNAS）的突变，腺瘤可被分为4个分子亚型。含有3号外显子β-连环蛋白激活突变的肝细胞腺瘤具有较高的转化风险，并且TERT启动子突变涉及恶性转化的最后一步，同时伴随全基因组低甲基化和染色体畸变的增加。与肝硬化相比，肝细胞腺瘤的发展顺序不同：在正常肝细胞中，CTNNB1激活突变首先与具有转化风险的单克隆良性增殖相关，而在肝硬化肝细胞中，TERT启动子突变发生得更早。可能的解释是肝硬化肝细胞可能需要早期端粒酶再激活才能增殖并逃避衰老。

2.3 基因毒性作用是HCC发展的原因

      与HBV相关的HCC可以看作是由病毒蛋白导致的结果，例如具有致癌特性的HBx或由于病毒基因组本身在癌症基因如TERT、CCNE1和MLL4中具有HBV插入突变。研究发现AAV2（腺相关病毒2型，一种DNA缺陷型病毒）在TERT、CCNA2、CCNE1、TNFSF10和MLL4中的插入突变与正常肝脏上的HCC发展相关。另一个复杂性来自于携带患者一生中暴露于环境致癌物印记的癌症基因组分析。对HCC中核苷酸突变谱的分析使得能够识别AFB1（黄曲霉毒素B1）暴露的肿瘤基因组特异性突变特征——高比率的C> A突变和在TP53中的特异性热点突变R249S。中国传统医学中使用的马兜铃酸暴露与尿路上皮癌的发展有关，其具有高度特异性的T> A颠换突变率。相同的突变特征在中国的一个HCC子集中被识别，表明马兜铃酸可能主要参与一部分患者的HCC发病机制。癌症基因组的分析有助于更好地了解影响HCC发展的生物事件，并使用分子流行病学方法帮助确定新的风险因素。

2.4 肝癌发生过程中的基因全景和驱动通路

      每个HCC基因组是体细胞基因突变独特组合的结果，每个肿瘤编码区域中的平均突变数量在从35~80个。对全外显子组测序研究的综合视图使得鉴定在HCC中高频突变的主要通路（图4~9和表1）。

表1.作为肝细胞癌治疗靶标的候选驱基因

2.4.1 端粒维持。 由于端粒酶再激活是恶性转化过程中的关键，因此90％的人类HCC具有端粒酶表达增加。端粒酶再激活的机制包括TERT启动子突变（54％~60％），TERT扩增（5％~6％）和TERT启动子中的HBV插入（10％~15％），它们之间具有互排性。TERT启动子突变通常与CTNNB1突变相关，表明端粒酶维持和 β-连环蛋白通路在肝脏肿瘤发生中的合作。

图4 端粒酶维持

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变；*：HBV整合高频目标基因）

2.4.2  WNT/β-连环蛋白信号通路。WNT/β-连环蛋白通路是肝脏生理胚胎发生、分区和代谢控制的关键。通过CTNNB1的激活突变（11％~37％）以及AXIN1（5％~15％）或APC（1％~2％）的失活突变，它是HCC中最常激活的致癌通路。编码 β-连环蛋白的CTNNB1突变一般是位于APC / AXIN1 / GSK3B抑制复合物靶向结构域中的热点区域的替换或框内缺失。CTNNB1突变的肿瘤也具有特异性转录组学特征，其具有经典靶基因如GLUL和LGR5的过表达，以及具有肿瘤内胆汁淤积的特定组织学模式。

图5 WNT/β-连环蛋白信号通路

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变）

2.4.3 P53细胞周期信号通路。在至少一半具有频繁TP53突变（12％~48％）的HCC患者中P53细胞周期发生改变。 除了与AFB1暴露相关的R249S突变外，未发现其他复发的TP53突变热点。控制细胞周期G1期至S期进展的视网膜母细胞瘤通路主要通过CDKN2A（2％~12％）或RB1突变（3％~8％）的纯合缺失在HCC中失活。CCNE1中的复发性HBV插入（细胞周期蛋白E1,5％）和CCND1 / FGF19基因座的扩增（5％~14％）在HCC的相关研究中被报道，这是参与细胞周期进展的两种关键蛋白。

图6 细胞周期基因

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变；*：HBV整合高频目标基因）

2.4.4 表观遗传修饰。表观遗传修饰在HCC中经常发生突变，ARID1A（4％~17％）和ARID2（3％~18％）的失活突变强调了SWI / SNF染色质重塑复合物（BAF和PBAF）作为肿瘤抑制因子的关键作用。组蛋白甲基化记录蛋白（writer，是指在表观遗传学中添加修饰的蛋白，通常是一些修饰酶）家族的经常性体系突变主要发生在MLL（3％~4％）、MLL2（2％~3％）、MLL3（3％~6％）和MLL4（2％~3％）基因上， MLL4中的HBV插入（10％）在HCC中也很常见。

图7 表观遗传修饰

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变）

2.4.5 氧化应激信号通路。在HCC中鉴定的经常性突变显示NRF2的激活作为肿瘤进展中的驱动事件。体外研究表明，NRF2激活可以保护肿瘤细胞免于暴露活性氧物质而引起的死亡。通过NRF2的激活突变（由NFE2L2编码）或在5％~15％的病例中使KEAP1失活来改变氧化应激通路，从而防止由KEAP1 / CUL3复合物泛素化生理学诱导的NRF2的蛋白酶体降解。

图8 氧化应激信号通路

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变）

2.4.6 PI3K / AKT / MTOR和RAS / RAF /MAPK信号通路。通过扩增FGF19 / CCND1基因座，PI3K / AKT / MTOR和RAS / RAF /MAPK信号通路在约5％~10％的HCC中被激活。 同时，PIK3CA的激活突变（0％~2％）和TSC1/TSC2的失活突变（3％~8％）导致HCC亚组中AKT / MTOR信号传导的激活。PTEN的纯合缺失在1％~3％的HCC中已被确定。在HCC（＜2％）中很少观察到属于RAS家族基因的激活突变。RSK2的RP6SKA3失活突变在2％~9％的肿瘤中被鉴定。实验数据表明，持续的RAS活化可能是HCC对索拉非尼耐药的机制。

图9  Akt/mtor 和MAPK信号通路

（红色：癌基因的激活突变；蓝色：肿瘤抑制因子的失活突变）

      在HCC中有2层来自分子分型的信息：作为预后或预测的生物标志物作用；增加我们对疾病分子发病机制的理解的能力。通过对HCC基因表达谱累积理解以及与其他分子信息水平的整合，作者总结了HCC的分子分型（图10）。HCC大致可分为2个主要分子亚型：（1）增殖类亚型，特征是富集与细胞周期中细胞增殖和进展相关的信号，并且通常与更具攻击性的表型相关；（2）非增殖类亚型，通常保留类似于正常肝脏生理学的分子特征。

图10 HCC分子分型综述

（基于mRNA表达图谱描述了HCC的主要分型：增殖亚型和非增殖类亚型，影响DNA结构，途径失调和表观遗传学的其他分子特征是重叠的）

       HCC分类的主干（backbone）依赖于基因表达的分析。目前的研究已经尝试通过组合基因组和表观遗传特征来增强癌症分型。

4.1 预后，HCC预后预测模型：

源自对肿瘤组织的分析

（1）综合临床特征的预测模型：巴塞罗那临床肝癌（Barcelona Clinic Liver Cancer）算法，该算法得到了美国和欧洲肝病研究协会（American and European Associations for the Study of Liver Diseases）的认可，该算法综合了肿瘤负荷、肝脏损害程度和癌症相关症状。

（2）基于转录组数据：如G3、5-基因、上皮细胞粘附分子、簇A（Cluster A）或类肝样细胞。

（3）基于表观遗传数据：如36-CpG DNA甲基化标记，20-miRNA标记，或HBV-HCC中miR-26的鉴定和验证（表2）。

这些模型中的大多数识别增殖亚型内的患者，5-基因评分也能够预测非增殖亚型类型预后。

源自相邻肝硬化组织特征的分析

       能够基于相邻肝硬化组织的特征判断预后从而对HCC患者进行分类。如富含186个与炎症相关的基因标记基因集能够确定HCC患者，这些基因集包括干扰素信号传导，EGF激活，核因子κB和肿瘤坏死因子α，这些主要是HCV相关的切除后存活率较低的患者，以及HCC发展风险较高的肝硬化患者。

       将来自癌组织和癌旁组织的基因组数据互补以最大化预测准确性（表2）。这些研究中预测模型的改进使得能够基于个体风险评估来进行预测。例如，将来自5-基因评分的数据与巴塞罗那临床肝癌算法和血管侵入相结合的列线图提供了个体的存活率估计。类似地，使用机器学习方法进行亚型识别和基于DNA甲基化的特征的预测提供了连续的风险梯度，这些最终可以提高结果预后预测的精确度。分析血液中的肿瘤副产物（包括cfDNA或CTC）技术的开发可以促进分子标志物的应用。

表2 肝细胞癌的预后特征

4.2 治疗

       在HCC中，唯一有效的全身性药物是BRAF /血管内皮生长因子受体/血小板衍生的生长因子受体抑制剂索拉非尼。在前面描述的体系突变和信号通路激活中，作者定义了可以使用生物标志的2个区域：（1）针对靶向信号级联或免疫检查点；（2）针对癌基因成瘾通路（oncogenic addiction loop）（ 表1和表2）。（注：“癌基因成瘾”是假定典型癌症具有不同的基因突变路径，而一些肿瘤仅依赖一个主要癌基因而生长存活，所以抑制这种特殊的癌基因可有效抑制肿瘤的生长）。

4.2.1 癌基因回路（Oncogenic loops）：DNA拷贝数变化

（1）HCC患者中VEGFA（染色体6p21中的增加）与其表达相关，并且基于荧光原位杂交结果估计的突变率为7％~11％，高VEGF血浆水平与较差的存活率相关。

（2）5％~14％的HCC中存在FGF19、CCND1（染色体11q13中的增加）异常，且与高表达水平和不良预后相关。用单克隆抗体阻断FGF19，可抑制体内克隆生长和致瘤性。临床试验证实FGF抑制剂Brivanib（高活性FGFR1-3抑制剂）未能改善未经选择的晚期HCC人群存活率。CCND1与FGF19共享基因组基因座，并且它也经常在癌症中扩增。 CDK4 / 6双重抑制剂，如Palbociclib或Abemaciclib，在实验模型中显示出抗肿瘤活性。

（3）5％~14％的HCC中FAK、MYC（染色体8q24的增加）有广泛的扩增，在一项研究中达到26%。在HCC的实验模型中抑制FAK可诱导肿瘤反应，FAK的选择性抑制剂目前正在临床开发中。目前开发抑制MYC的有效药理学策略一直具有挑战性。

4.2.2 基因突变

（1）CTNNB1在研究中非常普遍（约25％），CTNNB1突变是选择性靶向且有吸引力的候选者。

l TSC1 / TSC2都是mTOR级联的负调节剂，它们的失活促进了mTOR信号传导。 在2％~14％的HCC中存在其突变以及DNA拷贝数改变。在Ⅲ期临床试验，mTOR抑制剂依维莫司作为单一药剂二线治疗，其未能显著提高未经生物标志物选择的患者存活率，但该研究的亚组分析表明HBV患者的存活率增加，可能与该群体中较高的AKT / mTOR通路激活有关。

（2）小于3％的HCC患者存在NRAS / KRAS / HRAS突变。一项来自II期临床试验（即BASIL，NCT01204177）评估晚期HCC患者接受MEK抑制剂Refametinib（BAY86-9766）加索拉非尼联合检测，对cfDNA进行分析发现，大约6％的患者（69人中有4人）存在NRAS / KRAS / HRAS突变；这四名患者中有三名是部分反应（PR）。RP6SKA3中的失活突变更为普遍（2％~9％），并且可预测对RAS抑制剂的反应。

(3)  基于HBV-HCC中的全基因组测序数据，高达9％患者存在JAK1突变。实验证据表明其阻断可能具有抗肿瘤活性。

4.3 信号通路和免疫检查点

4.3.1 MET。 至少40％~50％的HCC样品中存在mRNA和蛋白质水平的过表达。 一项对Tivantinib（C-Met抑制剂）比对安慰剂的二线治疗2b期临床试验亚组分析表明，Tivantinib对免疫组织化学（IHC）上高表达MET的患者中特别有效。

4.3.2 IGF2。 在大约10％的HCC样品中富集到高转录水平的IGF2（＞20倍），这表明IGF2可以充当肿瘤驱动因子。功能验证表明IGF通路抑制剂可能是HCC的有效策略，但使用IGF-IR拮抗剂进行早期临床试验结果显示出有限的有效性和显著的毒性。

4.3.3 PD1/ PD-L1。PD1/PD-L1作为生物标志物具有潜在的作用。在HCC中肿瘤内PD1 / PD-L1的表达增加与不良预后相关，并且其在原位HCC模型中的抑制诱导肿瘤反应。

       总之，既往的研究已经能够描绘HCC发生发展中发生的突变和基因组改变情况。但研究者需要将这些知识转化为患者的实际优势，无论是在改善高危人群，患者预后和对治疗的反应方面。巨大的转化努力需要引起注意。HCC的研究团体必须将研究发现与实际生存获益联系起来，通过用生物标志物去定义患者亚型可能会产生更好的治疗方法，从而改变这种复杂和异质性疾病的决策过程。

点评

       肝细胞肝癌已经成为全世界范围关注的健康问题。该综述对HCC的基因全景和生物标志物做了详细的阐述。但从2015年到至今，肿瘤的精准治疗和免疫治疗得到了蓬勃发展。HCC的靶向治疗已经不局限于索拉非尼，替万替尼相关临床研究也正在进行，乐伐替尼、卡博替尼和雷莫芦单抗在晚期肝癌治疗中的疗效与安全性也逐渐被临床试验证实。近几年来免疫检查点抑制剂联合治疗的有效性也引起了研究者的关注。目前相关的肿瘤疫苗也获得广泛的关注，如CPC3肿瘤疫苗。（注：CPC3，glypican-3，磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3，是一种细胞膜表面的硫酸乙酰肝素糖蛋白）基于该综述的HCC分子机制，方便我们更好的去理解HCC的发生发展。

参考文献

Zucman-Rossi J, Villanueva A, Nault JC,et al. Genetic Landscape and Biomarkers of Hepatocellular Carcinoma [J].Gastroenterology. 2015 Oct;149(5):1226-1239.e4.【IF 20.773】