非小细胞肺癌的进化与基因检测！
非小细胞肺癌（NSCLC）患者治疗的难点在于肿瘤这个疾病的异质性，以及肿瘤细胞基因组随机产生突变导致的肿瘤病灶的进化问题。异质性包含肿瘤病灶内的异质性，以及肿瘤病灶周围微环境的异质性，这造成了肿瘤这一疾病治疗的难点。
有关肿瘤内异质性和肿瘤基因组进化的数据目前仅限于小型的回顾性研究，为了更好地研究肿瘤内异质性和临床治疗结果的关系，以及癌细胞进化过程中的决定性的因素，最近发布在新英格兰医学杂志的一项前瞻性研究为我们带了一些启示。
这项多中心研究由英国癌症研究所资助，目标入组人数为842例，这篇报道涉及到的人数是100人，是第一批早期非小细胞肺癌患者，在进行全身治疗前，这些患者的肿瘤病灶进行了全外显子组测序（全外显子组就是编码蛋白质的基因组序列全部测序）。
这100个肿瘤患者的病灶里选取了327个位点进行测序，通过癌细胞的克隆和亚克隆来研究非小细胞肺癌的进化历史，进而分析肿瘤内异质性和患者无复发生存之间的关系。
图1：早期非小细胞肺癌手术取样和测序分析
图1表明了研究的流程，早期非小细胞肺癌患者手术切除病灶，在病灶多个不相临的位置取样，对每个样本进行全外显子组测序，研究肿瘤病灶内的基因突变差异和变化趋势。
研究结果表明，肿瘤病灶内的异质性非常普遍，如体细胞的拷贝数扩增和基因突变。这里需要注意的是，亚克隆是指癌细胞发生了一些突变事件，导致一种癌细胞变成几种癌细胞，或者可以通俗地理解为父代和子代的关系，癌细胞克隆是父代，癌细胞亚克隆是子代。
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病友们比较熟悉的EGFR、MET、BRAF和TP53驱动肿瘤发生的基因突变几乎一直存在，研究发现75%的肿瘤出现了不同程度的进化过程，一些涉及到染色质修饰、DNA损伤应答和修复的基因，如PIK3CA和NF1等在肿瘤进化过程中比较常见。
也就是说一些驱动肿瘤发生的基因突变会一直存在，而后面经常会出现一些打酱油的基因突变，这些基因突变导致了肿瘤变得越来越复杂，从一种肿瘤细胞，变成了很多种肿瘤细胞的组合。
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肿瘤细胞的基因组会出现倍增，这种情况主要是癌细胞的基因组复制了，但是没有进行分裂，另外癌细胞内的染色质不稳定也很常见，这两个因素导致了一些驱动肿瘤发生基因扩增，如CDK4、FOXA1和BCL11A，正常细胞是一份基因拷贝，突然出现了十份或者几十份基因拷贝，也就导致了细胞的增殖失控和癌变。
图2：肿瘤内的异质性，通过此图可理解肿瘤患者之间的差异性非常大，可以说没有两个完全一样的肿瘤患者。
癌细胞这个细胞是不安分的，癌细胞染色质的不稳定性导致了肿瘤细胞不断产生新的突变（人体细胞的基因序列组合在一起就是染色质），而这些新的突变与患者复发、死亡是直接相关的。
这项研究的数据表明癌细胞的染色质不稳定性可以作为一个预后预测因子，对早期非小细胞肺癌的预后有一定参考意义。如图3所示。
图3：癌细胞亚克隆的突变、拷贝数扩增与无病生存的相关性
如图3所示，癌细胞亚克隆中存在基因突变，这个比例的高低对患者的无病生存影响不大。而如果癌细胞亚克隆是存在拷贝数变异，也就说一个关键进化事件，导致一些子代癌细胞的基因拷贝数倍增了，那么这会导致患者的预后较差。关于基因突变和拷贝数变异的区别请看下图。
图4：导致肿瘤内异质性的原因
上图表示的是导致肿瘤内异质性的原因：
如果发生了癌细胞只是单独地复制DNA，不进行分裂，就导致基因组倍增，所有的基因都表现出拷贝数扩增，正常是一份，现在是十份等。
如果是染色质不稳定则会导致一些基因的丢失、重排等，如ALK基因和EML4基因融合成为融合基因。
如果是单独一个基因位点的突变，则是我们比较常见的EGFR的L858R突变，T790M突变这种形式。
不同突变都会导致细胞的癌变，如果这些突变发生在细胞中，就导致出现更多种类的子代癌细胞，也称为癌细胞亚克隆。
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本篇研究表明
癌细胞亚克隆中的突变比例高低与早期非小细胞肺癌的预后无相关性，但是如果是拷贝数扩增，即如是发生了癌细胞基因组倍增、染色质不稳定等，则会影响早期非小细胞肺癌的预后，此一点也给后续从事二代基因检测业务的一个启示，即基因检测报告是否不要只单独给出一些位点，有无药物，而是能从癌细胞的突变形式、进化特点给出可能推测患者预后的线索。
本篇研究涉及的样本来源于早期非小细胞肺癌的手术组织样本，而且通过多个位点取样进行全外线组测序分析。某些可以通过靶向药物干预的突变位点如EGFR、ALK、MET等几乎完全出现在早期，而且在多个取样的病灶中都可以测到，这也可以解释为何靶向药物使用上以后，患者身体多个病灶能有反应，病情可以得到较好的缓解。
但是让人痛心的是，在早期肿瘤组织样本中就已经检测到了耐药基因突变如PIK3CA、NF1、KRAS、TP53和NOTCH等，这些基因突变直接或间接影响了靶向药物耐药的发生，或者通过影响基因组不稳定而倾向于产生更多的基因突变来增加癌细胞的适应性。而且多数情况下，这些耐药突变只存在某些区域的位点，这也预示着未来的基因组测序样本来源不该是单区域位点取样。多个病灶的位点取样，进行全外显子组测序对评估染色质不稳定是有帮助的。
目前关于液体活检，也就是通过抽血检测染色质不稳定的水平还不清楚。基因检测除去要继续努力增加单个位点的检出灵敏度以外，还需要发展更多的措施来评估癌症病灶的染色质不稳定性，染色质不稳定可以同时增加多个基因的拷贝数，进而影响了患者的无病生存情况。
如果我们可以通过一些治疗手段，干预这一进程，也就是不要让癌细胞的染色质不稳定性那么强了，逻辑上是有望提升患者无病生存率。
本篇研究没有给出什么具体数据，也就是吃什么药物可以治愈疾病，但是本文可以从思维上给出我们很多启示，主要归为以下几点：
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基因检测报告后续不应该是只为寻找靶向药物为主，如没有找到靶向药物就完全认为基因检测报告没有价值，是否可以通过患者基因突变的数目，什么基因突变，突变频率等来评估患者的染色质不稳定，结合免疫组化，MSI等指标来判断患者使用化疗、PD-1等疗效情况，以及对患者的预后有个评估和参考。
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基因检测单区域取样的局限性，早期肿瘤病灶就有如此复杂的异质性，晚期肺癌的异质性会更强，未来是否可以在手术病灶在多个位点取样，当然这里涉及到价格，因此片面地强调检测基因数目，倒不如推出个基因检测产品，可以取多个病灶，检测的基因数相对合适，不要太多，把价格降低。
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本篇研究涉及的是早期非小细胞肺癌，那么一个问题是早期非小细胞要不要进行治疗，尤其是I期的肺癌，早期引入一些治疗措施如化疗等会消灭潜在的病灶，但这些治疗措施本身也是一种进化选择压力，这会不会间接地增加了癌细胞的基因组不稳定，而这是否得不偿失呢。
参考文献：
1、Jamal-Hanjani M, et al., N Engl J Med. 2017 Jun 1;376(22):2109-2121.
2、Abbosh C,et al.,Nature. 2017 Apr 26;545(7655):446-451.
