生命的编程时代和科学的曲折向前之路
作者｜张岩
编辑｜陈光
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大家好，我是张岩。
2015年，CRISPR-Cas9基因编辑技术曾被《科学》杂志评为“年度科学突破”，相关应用也曾入选2014年与2016年的《麻省理工科技评论》“年度十大科技突破”。科学界相信，一个以基因编辑为基础的后基因组时代已经来临。
然而，近几日在《自然》子刊《Nature Methods》上发表的一篇通信文章却发现在小鼠的活体实验中，使用CRISPR技术虽然成功修复了导致小鼠失明的基因，但是却让小鼠体内出现超过1500个单核苷酸发生突变(SNVs)，并有上百个位点发生了大片段的缺失和插入。因此作者在文中建议应考虑使用全基因组测序来确认体内脱靶突变的存在。
虽然这则爆炸性的研究迅速成为了生物领域关注的热点，但我认为这篇一页出头的文章并不是实验证据充足的学术论文，而是一篇correspondence，不属于正式发表的科学结论。首先是文中实验样本数过少，无法确认出现大规模脱靶效应是CRISPR本身的问题还是实验的系统误差。其次该实验只是基于一个sgRNA的数据，而该sgRNA特异性评分很低，造成许多脱靶效应也在预料之中，无法证明其他sgRNA也会出现该现象。
科学发现的过程本就曲折，从文艺复兴到星际探索，伴随鲜花和掌声，但也是血泪相伴的艰苦征途。质疑、争论，无数次的尝试与修正，正是在这种螺旋式的前进甚至是倒退和再前进的过程中，在一次次对自我认知的颠覆中，人类一路从蛮荒走向文明，不可否认基因编辑技术是生命时代最伟大的成就之一，它的力量不可估量。
2017年基因编辑技术迎来了小高峰，技术的突破让它有很高的呼声在这两年赢得诺贝尔奖。目前全球很多基因编辑公司比如CRISPR Therapeutics和Editas已经获得了高额的风险投资，并且一旦新药研究或新疗法报批通过，它们的估值将会迅速上升，投资回报将会非常可观。今天我们就和张岩一起与你回顾基因编辑技术的发展历程，紧握这只改写未来的“上帝之手”。
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以下，供你参考。
逆天改命的终极理想
在人类繁衍和探索世界真相的漫长岁月里，人们逐渐认识到是一些看不见的神奇因子决定了每个生命个体独一无二的特性。
百年前，人类发现这种最终确定名为“gene”的遗传因子就深藏在每个细胞里，镌刻在已经绵延千年万载的DNA双链上，生命的根本随着它们代代相传。
“人类基因组计划”完成后，关于我们自身的秘密也大白天下。我们从根本上讲都是由生命的四张基本牌组成，这四张基本牌就是ATCG四种碱基，由它们组成DNA，一段有意义的DNA就叫做一个基因（gene），而所有基因在一起就叫做一个人的全基因组。
一副扑克牌除去大小王有52张，有黑红梅方四种花色。一个人的基因组也可以看做是一副牌，爸爸给了30亿张，妈妈给了30亿张，我们一共有30亿对。我们通常把这副扑克牌分成23摞，每一摞就叫做一条染色体。我们的美丑颜值，高矮胖瘦归根结底是这些牌的顺序不太一样。
当然直到今天，对于人类基因组这部天书，我们能读懂的部分仍然不多，但是就像人类科学史曾经无数次证明过的那样，更深入的探索和更深刻的理解将带来更伟大的力量。
当我们开始理解生命的真相后，我们就希望利用这些真相使我们自己变得更强大，强大到足以逆天改命，对上帝说“NO”。
早在1963年，刚好是DNA双螺旋结构发表10年，沃森获诺贝尔生理学或医学奖1年之后，美国分子生物学家、诺贝尔生理学或医学奖获得者乔舒亚·莱德伯格就预言，通过修改人体基因来治疗疾病的时代正在来临。
1990年，四岁的小女孩德希瓦尔因缺少腺苷脱氨酶( ADA) 而患重度联合免疫缺损和免疫系统功能低下。美国国立卫生研究院( NIH) 临床中心的威廉·弗伦奇·安德森博士收集她的白细胞，然后在体外利用逆转录病毒载体将能够正确编码腺苷脱氨酶的ADA基因插入到德席尔瓦的白细胞基因组中，最后将这些基因工程改造后的白细胞重新输回德席尔瓦体内。之后的检测证明，德席尔瓦体内的白细胞确实可以正确地合成腺苷脱氨酶。
基因治疗从科学家和科幻作家的幻想走进现实。第一次有生物开始从造物主的视角，向进化给人类带来的病痛折磨宣战。但是站在2017回望过去，在整个20世纪90年代，与其说基因治疗带来了全人类的生之希望，不如说带来了生命科学领域前所未有的泡沫。
革命性的概念和随之而来的巨大商业利益驱动着这个领域大跃进式发展，但是超高速发展的背后却是清晰的临床结论的缺失。截至2000年，全世界大约有4000名患者参与了500多个基因治疗的临床试验项目，其中77%来自美国，69%是针对癌症治疗。这些临床试验全部以失败告终，没有一项顺利进入到大规模临床应用阶段。
曾经的基因治疗之父威廉·弗伦奇·安德森面临22年的监禁
基因治疗20年，弹指间，灰飞烟灭
特别是1999年深秋，18岁的美国男孩杰西·格尔辛格参与了美国宾夕法尼亚大学基因治疗项目并接受腺病毒载体注射，4天后，因多器官衰竭死亡。依据后来的调查，格尔辛格很可能死于免疫系统对腺病毒载体的过度反应。尽管格尔辛格一家人表现出了宽容和对科学的奉献精神，但格尔辛格的死亡无疑代表着基因治疗进入最黑暗和最艰难的一段时期。
在全新的、高度复杂、个体化和涉及患者生命健康的技术领域，对于诸多关键问题缺乏深入、系统的探索与足够的认识。
在这种情况下，部分研究者在学术或者产业利益影响下的盲目乐观和激进在某种意义上阻碍科学进步与产业的发展。然而客观地、回顾性地来审视那个时期，有一点毋庸置疑，就是基因治疗标志着一个伟大时代的开始。
人类从此开始试图修改自身的遗传信息，对抗亿万年进化的代价。经历过惨痛的代价后，基因治疗领域摒弃商业诱惑、幻想与狂热，开始重归学术、希望与理性。但是从上世纪80年代基因打靶开始，到后面的ZFN，到再后面的TELEN，很多研究机构都进行了大量研究，但均由于效率低、耗时费力等缺陷而一直没有得到大规模应用，难以走进临床。直到2012年，一个高效简便的方法CRISPR-Cas9出现才峰回路转。该技术由于设计简单，靶向性强，短期内得到全面发展。
逆天改命的“手术刀”
CRISPR-Cas9是一种在大多数细菌和古菌中存在的天然免疫系统，它利用插入到基因组中的病毒DNA（CRISPR）作为引导序列，通过Cas (CRISPR相关酶)来切割并清除入侵的病毒基因组。
据美国Wired报道，丹麦丹尼斯克食品公司于2005年在一种嗜热链球菌基因组中发现特定的短回文重复序列与侵入该菌的噬菌体的基因片段高度相似，并意识到这些序列可能在细菌对噬菌体的防御中扮演了重要角色，这些重复回文序列被称为CRISPR。
2013年，张锋等科学家首次报道了CRISPR-Cas9系统在哺乳动物基因组编辑中的应用。2017年2月15日，美国专利局审查与上诉委员会作出裁决，判定张锋及麻省理工/哈佛MIT联合创办的BroadInstitute所申请的 CRISPR基因编辑专利，与加州大学伯克利分校Dougna实验室和欧洲合作者Charpentier的CRISPR发现，并不重叠或存在冲突， 因此张锋与Broad Institute得以保留其已经得到授权的CRISPR专利权。随后三天，Editas Medicine股价大涨40%以上。
FDA基因改造三文鱼和基因编辑蘑菇
这部分先不怼崔永元（以免拉低我们这个公众号的智商）。我们要谈谈比基因治疗更近一点的未来。
转基因食品这个概念正在被情绪化、政治化、泛伦理化乃至阴谋论化，我们在上一篇《A Chinese renaissance：中国生命科学的新千年》提到，转基因农业是人类社会的新希望，靠它可以解决人类社会面临的很多问题-病虫害防治、过渡依赖农药、第三世界的粮食安全等。
2015年11月19日，在确认其食用安全性五年、环境安全性三年之后，美国食物药品管理局（FDA）批准了水恩公司（AquaBounty）的转基因三文鱼品牌“AquAdvantage”上市，从而使之成为首个获批的供食用转基因动物。
AquAdvantage三文鱼的“本体”是大西洋三文鱼，但它体内有一个基因来自另外一种三文鱼——大鳞大麻哈鱼。
这项技术其实早在1989年就诞生了——那时加拿大的加斯·弗莱彻（GarthFletcher）博士和他的研究组首次实现了改变大西洋三文鱼的生长激素调节方式，使得它们能够全年生长，而不仅仅在春季和夏季生长。
这个基因并没有改变它们的生长激素的类型，只是提高了分泌水平；它也没有对最终的鱼肉产生影响，只是让鱼更快地生长到成年体型。另外，这种三文鱼体内还有一个来自美洲绵鳚的启动子——一个分子开关，用来调节生长激素的合成。
AquAdvantage三文鱼和与之同龄的标准大西洋鲑。
（图片来源：AquaBountyTechnologies）
基因改造的三文鱼的主要特点是生长迅速，仅需18个月便能长成——而常规三文鱼需要至少三年。
怎么吃合适？
绝对是抹上照烧酱吃烤鱼！再撒点小葱和柠檬汁，配上一杯好味的白葡萄酒和一碗喷香的肉菜烩饭。说不定还能用夏威夷产的转基因抗病毒木瓜做餐后甜点呢！
2016年4月，美国农业部(USDA)宣布将不会对采用基因编辑工具CRISPR–Cas9进行遗传工程改造的一种蘑菇实施管控。这一期待已久的决定意味着，无需通过该机构的管控过程就可以栽培和销售这种蘑菇——使得它成为了从美国政府那里得到绿色通行证的第一个CRISPR编辑生物。
经过基因编辑降低了能够导致褐变的酶的活性
蘑菇怎么吃？小鸡炖蘑菇！
我们看到利用基因编辑技术去修改农作物的基因，似乎可以绕过转基因食品安全担忧。过去五年间，已经有几种利用基因编辑技术开发的农作物进入市场。
比如土豆在冷藏过程中，淀粉会缓慢分解成蔗糖、葡萄糖和果糖，之后如果要进行油炸的话，糖类在高温下分解成一种致癌物丙烯酰胺。而Calyxt公司利用基因编辑技术破坏土豆基因组中的一个控制淀粉分解的基因，这样就可以减少致癌物的产生，再比如中国和韩国的科学家破坏猪基因组里抑制肌肉生长的基因，这样就可以生产瘦肉型的肉猪，等等。
我们只是看到了更多的可能，其实再狂热的转基因反对者也不可能隔离所有转基因产品，即使是崔永元。当今社会已经离不开转基因了，胰岛素大多是由转基因技术改造的细菌产生的；乙肝疫苗使用转基因酵母生产的；酸奶和啤酒也是用转基因菌种生产的；我们吃的猪肉、鸡肉使用转基因豆粕喂养的，等等等等。
基因编辑的光荣与梦想
基因编辑在农业领域已经初试锋芒，那么在基因编辑的主战场基因治疗领域又将有什么样的惊喜呢？
在生命科学领域我国已经走在世界的最前沿。2016年底世界上第一例基因编辑人体试验在中国进行。
中国四川大学华西医院肿瘤科主任卢铀的团队利用CRISPR技术对患者的免疫细胞进行基因编辑，使免疫细胞中负责编码PD-1蛋白的基因失去活性。
这种蛋白能调节细胞的免疫反应，而癌细胞利用这一特点在人体内扩散。10月28日，这名患者接受了第一次基因编辑细胞人体注射，以期在PD-1蛋白不发挥作用的情况下，基因编辑细胞能杀灭癌细胞。研究人员会在注射之后的6个月内关注参与患者是否出现严重副作用，6个月后再评估该疗法的效果。
四川大学华西医院肿瘤学教授卢铀
这个叫莱拉的小女孩， 3个月大时被确诊为急性淋巴细胞性白血病晚期，放疗无效，化疗无效，骨髓移植无效，当全世界的血液肿瘤专家认为她会很快去世的时候，来自法国Cellectis公司的基因科学家通过改造的免疫细胞结合基因编辑技术做出了一种超级药物，这个药物跟这个孩子的免疫系统不发生排斥反应，同时躲开了这个孩子使用的所有药物，她很快就康复了，这是精准医学最完美的组合拳。
2017年2月6日， Cellectis公司宣布其通用型CAR-T疗法UCART123获得了美国FDA研究型新药一期临床试验批准，这也是迄今为止全球第一个获得FDA批准的以CD123为靶点的通用性CAR-T临床试验产品，这预示着人类在战胜癌症之路上取得了前所未有的成功。
基因编辑还在创造着奇迹……
上帝之手
“曾经的天方夜谭已变得触手可及。”加州理工学院的大卫·巴尔提摩说，“改变人类遗传的技术已近在眼前，我们需要决定，我们的社会该怎样运用这种能力。”
当我们掌控了一种近乎神的力量之后，一些老生常谈，比如扮演上帝、定制婴儿又成了眼前亟待解决的问题。无论是试管婴儿、克隆、干细胞治疗、还是线粒体置换疗法，每当新一波基因技术出现，伦理站在科学的对立面时，这些问题就要被重新提起。
担忧不是没有道理：基于CRISPR-Cas9技术的基因编辑在技术上远未成熟，此时轻率启动人类胚胎和生殖细胞的基因编辑，很有可能出现意想不到后果。
来自宗教、法律和普通大众的批评和质疑也顺理成章，对人类自身的遗传改造将会在根本上动摇人类社会的价值观。人何以为人？如果混合了其他生物的基因，人还是人吗？修改人类基因是否会造成永久性的阶级分化和不平等？父母和医生替孩子决定他们的基因，这样做是否道德？
然而存在风险与未知并不是阻碍科学进步的理由。
《三体》作者刘慈欣在科幻小说《天使时代》中写到：当分子生物学对生物大分子的操纵和解析技术达到一定高度时，这门学科就面对着它的终极目标：通过对基因的重新组合改变生物的性状，直到创造新生物。这时，这门科学将发生深刻变化，将由操纵巨量的分子变为操纵巨量的信息，这对于与数学仍有一定距离的传统分子生物学来说是极其困难的。
直接操纵四种碱基来对基因进行编码，使其产生预期的生物体，就如同用0和1直接编程产生WINDOWS XP一样不可想象。
依塔最早敏锐地意识到这一点，他深刻地揭示出了基因工程和软件工程共同的本质，把基础已经相当雄厚的软件工程学应用到分子生物学中。他首先发明了用于基因编程的宏汇编语言，接着创造了面向过程的基因高级编程语言，被称为“生命BASIC”；当面向对象的基因高级语言“伊甸园++”出现时，人类真的拥有了一双上帝之手。
青山遮不住，毕竟东流去。
生命的编程时代，正向我们走来。
参考文献：
Unexpected mutations after CRISPR–Cas9 editing in vivo. Nature Methods 14,547–548 (2017)
CRISPR repair reveals causativemutation in a preclinical model of retinitis pigmentosa. Mol. Ther. 24, 1388–1394 (2016).
上帝的手术刀-基因编辑简史 王立铭 浙江人民出版社
天使时代 刘慈欣
