谈谈AAV在肿瘤、癌症基因治疗中的应用（第二期）
4、rAAV(重组腺相关病毒）介导的RNA干扰及基因编辑
RNA干扰（利用ncRNA）即转录后基因沉默技术。ncRNA是指不能翻译为蛋白的功能性RNA分子,其中常见的具调控作用的非编码RNA包括小干涉RNA(siRNA)、miRNA、piRNA以及近期较热的长链非编码RNA（LncRNA）与环装RNA（circRNA）。在近十余年的生命科学研究中非编码调控RNA可谓是研究最火的领域之一，从06年诺奖的siRNA，到这几年异常火爆的microRNA，到即将登场并定能风靡的lncRNA(长链非编码RNA)，可谓如火如荼。
作用机制
1 编码蛋白的基因上游启动子区转录，干扰下游基因的表达；
2 抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰，影响下游基因的表达；
3 与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，干扰mRNA的剪切，形成不同的剪切形式；
4 与编码蛋白基因的转录本形成互补双链，在Dicer酶的作用下产生内源性siRNA；
5 与特定蛋白质结合，lncRNA转录本可调节相应蛋白的活性；
6 作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体；
7 结合到特定蛋白质上，改变该蛋白质的细胞定位；
8 作为小分子RNA（如miRNA、piRNA）的前体分子。
目前，已经有研究者利用rAAV(重组腺相关病毒）载体开发出多种基于RNAi的基因治疗药物。在肿瘤发生过程中，肿瘤细胞中的一些miRNA表达量明显低于正常细胞，有些miRNA甚至丢失，这些miRNA与肿瘤发生信号通路有关，将miRNA/rAAV通过尾静脉注入肝癌模型鼠体内，发现肿瘤细胞增殖受到抑制，并发生特异性凋亡。siRNA药物诱导的RNAi具有高效性和特异性，通过AAV将干扰与肿瘤生长和转移相关因子的siRNA导入肿瘤细胞来阻断肿瘤的生长与转移，如VEGF。
基因编辑技术（genome editing）是一种可以在基因水平上对DNA序列进行改造的遗传操作技术。这种技术的原理是构建一个人工内切酶，在预定的基因组位置切断DNA，切断的DNA在被细胞内的DNA修复系统修复过程中会产生突变，从而达到定点改造基因组的目的。
DNA修复系统主要通过两种途径修复DNA双链断裂（double-strand break,DSB）,即非同源末端连接（Nonhomologous end joining, NHEJ）和同源重组（homologous recombination, HR）。通过这两种修复途径，基因组编辑技术可以实现三种基因组改造的目的，即基因敲除，特异突变的引入和定点转基因。
利用CRISPR技术，借助AAV病毒载体，成功构建小鼠TRAC基因敲除并具有抑制肿瘤细胞生长的CAR-T（欲详细了解，请进群交流--QQ群-550803284）细胞，用该基因特定敲除的CAR-T细胞治疗肿瘤细胞移植小鼠，可显著延长修饰小鼠存活时间。
5、rAAV(重组腺相关病毒）介导的免疫治疗
在以病毒为载体的基因治疗中，可利用病毒蛋白增强机体免疫力，同样也可以用肿瘤细胞表面的抗原蛋白来诱导针对肿瘤的免疫反应。YU等利用rAAV-Her-2-neu抗原肽感染DC,通过DC的抗原呈递作用，在体外诱导出大量针对卵巢癌细胞的杀伤性T细胞（CTL）,其中CTL受MHC class I限制。
6、rAAV(重组腺相关病毒）介导的联合治疗
在肿瘤治疗过程中，单一的治疗方法很容易使肿瘤细胞产生抗性，联合治疗更有效。例如基因治疗结合化疗对肿瘤更有效，目前看来是肿瘤治疗最适宜的方法。
Tem和Cis都可增强rAAV-TRAIL（国内某公司在研发中）对肿瘤的杀伤作用；rAAV携带IFN-B和TRAIL对肿瘤也有增强治疗效应。Ad是rAAV的辅助病毒，二者结合既可以增强转导效率，也可使治疗基因相互协调作用。
7、问题及展望
作为基因药物的载体，rAAV具有自身的优势，但其潜在的免疫性及理论上因随机整合带来的基因失活或致癌性给人们带来了顾虑。进一步降低其毒性及免疫原性，增强其靶向性，进行大规模生产目前都是rAAV研究的瓶颈，优先解决这些问题的必然是时代的弄潮儿。目前，rAAV基因药物的安全性及其对肿瘤良好的治疗效果，使人们对其在治疗肿瘤方面充满信心，如果能克服其缺陷与局限性，将会大力推进其在临床的广泛应用。
自十三五规划实施后，近日，国家科技部、国家卫生计生委、体育总局、食品药品监管总局、国家中医药管理局、中央军委后勤保障部等六部委联合印发《“十三五”卫生与健康科技创新专项规划》。规划中明确要求加强干细胞和再生医学、免疫治疗、基因治疗、细胞治疗等关键技术研究，加快生物治疗前沿技术的临床应用，创新治疗技术，提高临床救治水平，由此可见基因治疗距离真正临床应用的黄金期即将到来。
