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CRISPR/Cas9系统在哺乳动物细胞中进行基因编辑(2)

2017-06-10 16:56:14生信草堂

sgRNA Design

 


 


 

上期简要介绍了CRISPR/Cas9系统的组成、结构及功能,以及利用该技术进行基因编辑的主要流程。本期将大家介绍如何有效设计sgRNA。


sgRNA 设计在线工具:

1.http://crispr.mit.edu/

2.http://www.broadinstitute.org/mpg/crispr_design/      

3.http://spot.colorado.edu/~slin/cas9.html

4.http://www.e-crisp.org/E-CRISP/

5.http://flycrispr.molbio.wisc.edu/

6.http://www.flyrnai.org/crispr/Drosophila/     

7. http://cas9.cbi.pku.edu.cn/index.jsp

8. http://eendb.zfgenetics.org/casot/index.php

9. http://zifit.partners.org/ZiFiT/ChoiceMenu.aspx

10. http://cas9.wicp.net/

11. http://cropbioengineering.iastate.edu/cgat 

12.http://crispor.tefor.net/

 


sgRNA设计:

根据编辑位点,将该位点附近序列片段输入在线设计软件的input对话框中,选择位置合适以及脱靶效率较低的sgRNA。根据所选择的内切酶,在sgRNA(表达sgRNA的模板DNA)两端加上粘性末端接头。


 


 

5‘-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3’
 

3‘- CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-CAAA-5’

例: 以质粒PX459 (pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例,Bbs1 酶切

1)    基因水平敲除: sgRNA尽量选择在启动子、功能比较重要或者序列比较保守的外显子上

2)    敲入特别是单碱基编辑,Cas9蛋白切割位点位于sgRNA17与第18碱基之间即靠近3’端PAM序列选择的sgRNA使插入位点靠近Cas9蛋白切割位点。

以最后一款sgRNA设计工具crispor http://crispor.tefor.net/)为例

Step1. 根据实验目的,将从数据库(NCBI Ensemble UCSC)得到的序列输入以下对话框,该在线设计工具crispor能输入的序列较长(<1000bp),张峰实验室开发的crisprhttp://crispr.mit.edu/)对输入的序列长度范围则较窄(<250bp


Step2. 选择你所需要的reference genome 版本。

Step3. 选择你所使用的Cas9系统,不同系统的‘PAM’有所不同


根据结果列表中,选择各项得分较高的sgRNA, 考虑off-target 预测位点所在的基因是否与目的基因功能相近,若相近则重选。

以上,sgRNA设计完成。

表达载体构建


 

质粒获取:目前该技术已经很成熟,除了从addgene 获取(周期较长,且手续繁多),国内很多生物公司都能购买。

1)Cas9-sgRNA 共表达载体构建。以PX459 (pSpCas9(BB)-2A-Puro (PX459) V2.0)为例。

a. SgRNA 合成后,磷酸激酶PNK磷酸化、退火。

b. PX459质粒双酶切,因该质粒有两个相邻的BbsI 酶切,且产生的粘性末端不互补,故该质粒只用BbsI 酶切即可。

c. 若SgRNA 为PCR合成,则sgRNA也需双酶切。

d. 酶连,转化,涂平板,摇菌,提质粒。注:根据质粒抗性基因加入抗生素。

2)PCR 验证sgRNA是否成功克隆到sgRNA表达载体中。以sgRNA 其中一条链为PCR引物,另一条自行设计。

3)sanger 测序验证sgRNA表达载体是否成功构建,测序引物与PCR引物同。