首次发现：通过基因敲除可消除活组织中的衰老细胞

2017-06-28 14:43:46APExBIO

细胞衰老是细胞周期停滞的永久状态，其保护有机体免受肿瘤发生，并在损伤和组织重塑期间调节组织完整性。然而，衰老期间衰老细胞在组织中的积累导致与年龄有关的病理反应。因此，需要更深入地了解调节衰老细胞生存力的机制。在这里，来自魏茨曼科学研究所的一篇研究显示CDK抑制因子p21（CDKN1A）维持DNA损伤诱导的衰老细胞的活力。在p21沉默后，衰老细胞获得多个DNA损伤，从而激活ATM和NF-κB激酶，导致细胞存活率降低。NF-κB活化诱导TNF-α分泌和JNK活化，以caspase和JNK依赖性方式介导衰老细胞的死亡。值得注意的是，p21敲除小鼠消除了衰老的肝星状细胞，减少了肝纤维化和胶原蛋白的产生。这些发现确定了调控衰老细胞活力和纤维化的新机制。

细胞衰老（Cellular senescence），是细胞周期停滞的永久形式，对各种应激源包括端粒缩短，致癌基因激活和DNA损伤等作出反应来停止细胞增殖。细胞衰老在短期损伤后的组织稳态中起着重要作用，促进肝脏损伤后的组织修复，皮肤纤维化和伤口愈合过程中的组织修复。

衰老细胞表现出升高的衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）活性和持续的DNA损伤反应，使其与其它非增殖细胞群区分开。衰老细胞产生多种特征性分泌因子，统称为衰老相关分泌表型（SASP），其以自分泌的方式加强衰老停滞并介导衰老细胞的免疫监视。然而，随着衰老，衰老细胞在生物体中积累并促进局部炎症，其以细胞非自主的方式驱动组织衰老，组织破坏以及潜在的肿瘤发生和转移。

衰老程序由信号通路的复杂相互作用驱动。如利用 p16INK4A （CDKN2A）和p53 （TP53）靶向p21 （CDKN1A），抑制细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs），从而抑制增殖相关基因的表达。另外， NF-κB作为SASP的主调节剂，影响衰老细胞的微环境和它们的免疫监视。通过免疫系统清除衰老细胞是限制其在组织中长期积累的必要条件，在组织中长期积累可能源自衰老细胞对凋亡的固有抗性。

驱动衰老的机制已经被广泛研究，但使其长期积累在组织中的机制尚不清楚。最近，有研究显示抗凋亡BCL-2家族成员BCL-W，BCL-XL和BCL-2促进衰老细胞对凋亡的抗性。然而，调控衰老细胞对细胞死亡的抗性的通路尚未确定。一方面，衰老细胞不能将p53蛋白积累至凋亡所需的水平。另一方面，p53靶向p21，通过其促进细胞周期抑制，从而保护细胞免受凋亡。这种作用可能由促凋亡蛋白BAX的p53依赖性和不依赖性上调，或通过激活肿瘤坏死因子（TNF-α）或影响DNA修复来调控。

因此，本文中，作者开始探讨p21如何调控DNA损伤后衰老细胞的生存力。

作者用DNA损伤剂依托泊苷（“DNA损伤诱导的衰老”，DIS）处理正常人肺成纤维细胞（IMR-90）来诱导衰老。发现诱导的衰老细胞的细胞周期停滞，衰老标记物p16，p21，p53 和衰老相关的β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）表达。p21的沉默降低了DIS细胞的生存力。同样，用依托泊苷诱导人肺癌H1299细胞的衰老，同样，p21的沉默降低了细胞的生存力。

在人皮肤成纤维细胞中转染p21 siRNA，并进行RNA测序分析。发现DIS细胞中p21沉默后，细胞周期调节因子，转化生长因子-β（TGF-β），DNA损伤反应和局灶粘连信号通路发生了变化。如COL1A1表达降低，细胞周期调节因子CDK-1 和cyclin A2的表达升高，TNF-α和Smad-7表达升高（TNF-α和Smad-7负向调节TGF-β）。

为了探究衰老细胞的死亡诱导机制，测试了涉及DNA损伤反应（DDR）蛋白质的磷酸化水平：共济失调毛细血管扩张症突变基因（ATM），CHK2，γH2AX，和P53。免疫印迹结果显示p21沉默的DIS细胞中所有这些蛋白质的磷酸化水平显著增加。单细胞凝胶电泳发现p21的沉默导致DIS细胞中DDR增强。DDR的增强伴随着ATM的激活增加，驱动NF-κB通过TNF-α/ TNFR1信号通路激活JNK。

p53和E2F参与凋亡的诱导，p53或pRb / E2F与p21的联合沉默对衰老细胞死亡的影响跟单独沉默p21相比没什么区别。用pancaspase抑制剂Q-VD-OPh（QVD）处理DIS细胞，仅部分地拯救细胞活力，而caspase-3（半胱天冬酶-3）的活性被完全阻断。用caspase抑制剂z-VAD-fmk处理细胞，caspases被抑制，获得了类似的结果。鉴于caspase抑制剂在p21沉默后没能够完全挽救DIS细胞，推测p21沉默通过caspase依赖和caspase非依赖机制诱导细胞死亡。p21沉默后，用JNK抑制剂SP600125处理DIS细胞，发现JNK磷酸化水平降低，JNK的抑制对细胞生存力没有影响。同样，单独敲除JNK对衰老细胞的活力无影响，也无法拯救衰老细胞的死亡。当沉默JNK结合QVD处理后，可拯救由p21沉默引起的衰老细胞的死亡。表明在DIS细胞中p21沉默诱导的细胞死亡是caspase和JNK依赖性的。

肝纤维化中，活化的肝星状细胞（HSCs）变得衰老，以限制肝脏损伤引起的增殖。为了确定p21对病理状态下体内衰老细胞活力的影响，作者用纤维发生剂CCl4处理野生型小鼠和p21敲除小鼠。发现p21敲除小鼠中衰老细胞显著减少，纤维化分子标志物的表达降低，胶原蛋白产生减少。表明p21的敲除减轻肝纤维化。这个发现代表了通过基因敲除可有效减少活组织中衰老细胞数量的第一个证明。