新型RNAi载体诞生，让基因沉默来得更猛烈一点
作者：解螺旋.子非鱼 解螺旋原创
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近日，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所国家蛋白质科学中心吴立刚研究组在Nature Communications上发表文章，公布一项新的研究成果：发明了一种比传统shRNA（short hairpin RNA）更为安全的高效RNA干扰（RNAi）载体—saiRNA。
RNAi技术的前世今生
造物真的很神奇。生物体有很多机会被来自病毒、细菌等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内。但宿主会说，“你有张良计我有过墙梯”，这个过墙梯就是RNAi：宿主细胞会对这些外源性基因dsRNA随即产生反应，被核酸内切酶Dicer切割成小片段RNA（即siRNA）。siRNA再与体内一些酶结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA进行特异性结合并将其切割，使得 mRNA降解。然后siRNA还会“乘胜追击”，可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。
在RNAi感染过程中,产生dsRNA的一个有效方法就是在体内表达一个短发夹RNA分子,这种shRNA包含两个短反向重复序列(其中一个与目的基因互补),中间由一个loop序列分隔,组成发夹结构。在体内shRNA可以被加工siRNA。
传统shRNA脱靶作用大且抑制miRNA
众所周知，利用生物体的 RNAi现象发展出来的RNAi技术是目前最“喜闻乐见”的基因沉默技术。
在科研中制备siRNA的方法主要有化学合成法和转录法。其中，转录法，通俗点说就是“借腹生子”。就是通过DNA载体，利用细胞内源的RNA聚合酶Ⅲ（RNA PolⅢ），如U6、H1等的启动子驱动转录表达shRNA，转录产生的发夹状shRNA可以被细胞内源的Dicer蛋白识别并加工成siRNA，然后与Ago蛋白结合发挥作用。将这些shRNA的表达框用质粒或者腺病毒等包装一下转入宿主体内，就可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因。
虽然这项技术可以实现在动物整体或特定组织中沉默靶基因，但是不可避免的是在这个过程中siRNA会“乱来”，比如，偶尔会饥不择食，慌不择路地与非特异的RNA序列结合，把人家该正常表达的“无辜”基因沉默掉，这就是所谓的脱靶作用（off-target）。
作为siRNA的前身shRNA也会瞎捣弄，就是对细胞内源miRNA的竞争抑制。由于shRNA的加工需要细胞内的Dicer、Exportin-5、Ago等蛋白质因子协助，而这些万人迷般的蛋白质因子也是细胞内源miRNA加工成熟所必须的。由于miRNA是细胞功能的重要调控分子，过表达的shRNA与内源miRNA竞争相同的加工机器，必然对内源miRNA的表达和功能造成抑制作用。shRNA瞎捣弄的后果可以很严重，比如在小鼠肝脏中长期高表达shRNA会造成严重的肝脏损伤并引发肝癌导致动物死亡。
因此，设计一种低毒副作用的RNAi载体进行高效沉默靶基因很重要。
saiRNA的优越性：高效率、低脱靶
而吴立刚研究组对具有不同茎环结构的siRNA前体的加工和功能进行了深入研究，并在此基础上发明了一种比传统shRNA效率更高，脱靶作用更少的新型RNAi载体－－saiRNA（single-strandedAgo2-processed interfering RNA）。
在RNAi发挥基因沉默功能的过程中，RISC复合物是核心成分，主要由外源提供的siRNA与细胞内的Ago家族蛋白质组装形成。哺乳动物中其蛋白家族有四成员：Ago1、2、3、4，但只有Ago2是RNAi的“真爱”，具有RNAi活性（切割完全互补配对RNA的核酸内切酶活性），而Ago1、3、4没有RNAi活性却会引起较强的脱靶作用。传统shRNA产生的siRNA“很博爱”，能与所有Ago蛋白结合不同， 但吴立刚研究组发明的saiRNA只有与Ago2结合后才能被加工产生成熟的siRNA，因此有效避免了与Ago1、3、4介导的脱靶作用，从而显著增强了其对靶基因的沉默效率。
（shRNA和saiRNA加工及作用机制图）
saiRNA的“专一”还体现在：与Ago2结合后加工产生成熟的siRNA，其特殊的加工方式只产生一条导向链（guide strand，具有基因沉默功能的siRNA链），不会产生passenger strand（与guide strand互补配对的没有基因沉默功能的siRNA链），因此也就完全避免了由passenger strand与Ago蛋白结合后产生的脱靶作用。
saiRNA的优势还在于对细胞内源miRNA的影响小。这个逻辑有点绕，就是，不论是化学合成的saiRNA，还是基于RNA聚合酶III的DNA表达载体在细胞内转录生成的saiRNA，因为对Ago2的专一，其被加工后产生的siRNA的单位浓度分子对靶基因的抑制效率都高于传统的shRNA。因此，在同样的沉默效率下，saiRNA产生的成熟siRNA在细胞内的积累量要远低于shRNA，避免了占用大量Ago蛋白，并且其加工不需要Dicer等miRNA加工所必须的“万人迷”蛋白质因子，因此不会跟细胞内源miRNA争抢，更不会对内源miRNA的表达和功能造成抑制作用。
所以，saiRNA作为一种新型的RNAi载体，具有高效和低脱靶的特点，通过对saiRNA设计的继续优化，以及动物整体的基因沉默实验，将为科学研究和基因治疗应用提供更为安全高效的工具。
