方兴未艾：单碱基基因编辑技术
BioArt按：近一年多来，全世界范围内多个实验室围绕“单碱基基因编辑技术”发表了大量的研究成果，而我国科学在此领域也取得了一系列重要进展。特别是近日，来自中山大学松阳洲和黄军就实验室在Protein & Cell杂志上发表了题为“Effective gene editing by high-fidelity base editor 2 in mouse zygotes”的研究论文，利用具有更高特异性的碱基编辑系统HF2-BE2在小鼠受精卵进行基因编辑，该成果具有十分重要的应用前景。有鉴于此，BioArt围绕这篇最新的研究成果系统梳理了过去发表的系列相关论文。
自2016年4月David Liu实验室在Nature上首次报道单碱基基因技术以来，紧接着日本神户大学Akihiko Kondo实验室和我国上海交通大学常兴实验室先后在Science和Nature Methods发表了不同类型的碱基编辑系统【1-3】。David Liu实验室基于大鼠的胞嘧啶脱氨酶APOBEC1开发了第二代和第三代单碱基编辑系统：APOBEC-XTEN-dCas9-UGI （BE2）和APOBEC-XTEN-Cas9n-UGI（BE3）【1】；而Akihiko Kondo实验室则基于七鳃鳗的胞嘧啶脱氨酶PmCDA1开发了dCas9-PmCDA1-UGI和Cas9n-PmCDA1-UGI单碱基编辑系统【2】；常兴实验室则基于人源AID开发了dCas9-AIDx单碱基编辑系统，用于耐药突变的筛选【3】。
2017年2月，韩国首尔国立大学Jin-Soo Kim则在Nature Biotechnology报道了将David Liu实验室开发的BE3系统用于小鼠受精卵基因编辑（下图）【4】。
紧接其后，2017年6月，中山大学松阳洲和黄军就实验室报道了利用具有更高特异性的碱基编辑系统HF2-BE2在小鼠受精卵进行基因编辑，而David Liu实验室报道构建HF-BE3在细胞水平进行基因编辑（下图）【5,6】。
单碱基编辑系统能够将单个碱基C>T(G>A)，但并不是那么精确。由于脱氨基酶的活性窗口比较大，它能够将邻近的C都变成T【1】。为了提高单碱基编辑系统的准确性，David Liu实验室通过对rAPOBEC1进行突变，构建了4种不同的突变，显著缩小的活性窗口，提高了单碱基编辑技术的准确性【7】。而单碱基编辑系统的准确性还取决于gRNA和Cas9是否存在脱靶。2017年4月，Jin-Soo Kim实验室在Nature Biotechnology上发表了利用Digenome-seq的方法研究单碱基编辑系统BE3的脱靶效应【8】，发现BE3系统的脱靶位点远远少于CRISPR/Cas9系统，证明单碱基编辑系统具有很高的特异性【8】。在随后不到一个月时间内，中山大学松阳洲和黄军就团队报道了利用具有更高特异性的碱基编辑系统HF2-BE2在小鼠受精卵中进行基因编辑的成果【5】。
松阳洲和黄军就团队从Cas9蛋白结构优化入手，改造Cas9蛋白以提高gRNA靶向的特异性。他们通过对BE2中的Cas9蛋白引入N497A/R661A/Q695A/Q926A/D1135E五个突变制备了HF2-BE25。该团队研究人员在小鼠模型制备过程中发现，与BE3系统不同，HF2-BE2系统在小鼠胚胎中能够将non-target链和target链上的C转变成T，扩展了的单碱基编辑系统的应用范围【5】。
首尔国立大学和中山大学的两篇小鼠胚胎单碱基编辑的文章对于编辑过程中的Indels产生有不同的见解：Jin-Soo Kim组发现BE3系统会产生Indels，并提出Indels可能是由Cas9 nickase的单链DNA切割活性导致的【4】。松阳洲和黄军就团队利用HF2-BE2也发现了Indels，他们指出这些Indels是由于胞嘧啶脱氨酶的脱氨基作用所导致的【5】。通过全基因组测序，中山大学团队发现HF2-BE2在小鼠胚胎中具有很高的特异性【5】。
此外，David Liu组通过对BE3系统中的Cas9蛋白引入N497A/R661A/Q695A/Q926A四个突变制备了HF-BE3，他们利用细胞模型证明了HF-BE3比普通BE3具有更高的特异性，并进一步证明利用转染HF-BE3蛋白方法会比转染表达质粒的方法具有更高的特异性【6】。
此外，特别值得一提的是，在农作物研究领域，中科院上海生命科学研究院上海植物逆境生物学研究中心的朱健康实验室、中国农业科学院作物研究所的夏兰琴实验室和中科院遗传与发育生物学研究所高彩霞实验室分别在Molecular Plant和Nature Biotechnology报道了将单碱基编辑技术（BE2和BE3）应用于植物（小麦，水稻，玉米）基因编辑【9-11】。
单碱基编辑技术的迅猛发展，将使得单碱基编辑系统变得越来越精确，有朝一日，单碱基编辑系统可能极大地推动疾病模型制备、动植物的育种和人类疾病的临床治疗。
参考文献：
1. Komor, A.C., Kim, Y.B., Packer, M.S., Zuris, J.A. & Liu, D.R. Programmable editing of a target base in genomic DNA without double-stranded DNA cleavage. Nature 533, 420-424 (2016).
2. Nishida, K. et al. Targeted nucleotide editing using hybrid prokaryotic and vertebrate adaptive immune systems. Science 353 (2016).
3. Ma, Y. et al. Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nature methods 13, 1029-1035 (2016).
4. Kim, K. et al. Highly efficient RNA-guided base editing in mouse embryos. Nature biotechnology 35, 435-437 (2017).
5. Liang, P. et al. Effective gene editing by high-fidelity base editor 2 in mouse zygotes. Protein & cell (2017).
6. Rees, H.A. et al. Improving the DNA specificity and applicability of base editing through protein engineering and protein delivery. Nature communications 8, 15790 (2017).
7. Kim, Y.B. et al. Increasing the genome-targeting scope and precision of base editing with engineered Cas9-cytidine deaminase fusions. Nature biotechnology 35, 371-376 (2017).
8. Kim, D. et al. Genome-wide target specificities of CRISPR RNA-guided programmable deaminases. Nature biotechnology 35, 475-480 (2017).
9. Lu, Y. & Zhu, J.K. Precise Editing of a Target Base in the Rice Genome Using a Modified CRISPR/Cas9 System. Molecular plant 10, 523-525 (2017).
10. Li, J., Sun, Y., Du, J., Zhao, Y. & Xia, L. Generation of Targeted Point Mutations in Rice by a Modified CRISPR/Cas9 System. Molecular plant 10, 526-529 (2017).
11. Zong, Y. et al. Precise base editing in rice, wheat and maize with a Cas9-cytidine deaminase fusion. Nature biotechnology 35, 438-440 (2017).
