等位基因特异荧光PCR检测ALDH2基因多态性
背景介绍：
目的：了解人群乙醛脱氢酶2（ALDH2）基因多态性的分布，评价等位基因特异荧光聚合酶链反应（PCR）检测ALDH2基因应用于临床的可行性。
方法：采用等位基因特异荧光PCR和DNA测序法同时检测375例患者外周血ALDH2基因型，结果不一致的标本采用基因芯片技术进行复检。
研究结果：
一、 real-time ASA PCR与DNA测序法检测ALDH2基因c.1510位点（G/A）突变的比较
375例外周血标本中，DNA测序法检出ALDH2*1/*1、ALDH2*1/*2、ALDH2*2/*2型的频率分布为65.6%（246/375）、28.8%（108/375）、5.6%（21/375）(见图1)， realtime ASA PCR的结果分别为66.1%（248/375）、28.5%（107/375）、5.4%（20/375）（见图2）。2种方法检测ALDH2基因型差异无统计学意义（χ2=1.33，P=0. 392），且一致性较好（κ= 0. 978，P＜0.001）；2种方法基因型检测结果一致率为98.9%（371/375）。（见表1）
二、基因芯片法检测real-time ASA PCR与DNA测序法结果不一致的标本
375例标本中，real-time ASA PCR和DNA测序法共有4例结果不一致，采用基因芯片法进行检测，结果与real-time ASA PCR完全一致。(见图3、表2)
图1：ALDH2 1510位核苷酸G或A多态性测序图
图2：ALDH2 1510位核苷酸G或A多态性荧光PCR结果
注：红色扩增曲线为外控扩增曲线，绿色扩增曲线为标本扩增曲线
表1：real-time ASA PCR和DNA测序法检测ALDH2 基因型的比较
图3：ALDH2 1510位核苷酸G或A多态性基因芯片结果图
表2：基因芯片法检测real-time ASA PCR与DNA测序法结果不一致的标本
得出结论：
ALDH2是一种四聚体蛋白，可催化乙醛氧化为乙酸。研究显示ALDH2基因型可影响饮酒者对乙醇的敏感性和耐受性。还有研究发现，ALDH2是催化硝酸甘油代谢成有扩血管作用的一氧化氮（nitric oxide，NO）的关键酶。因此，可根据ALDH2基因型制定患者的个体化治疗方案。即如果患者基因携带ALDH2*1/*2或ALDH2*2/*2，则硝酸甘油在体内的生物转化过程受阻，难以发挥药物作用 ，必须调整治疗方案。另外，有研究显示ALDH2*2还与多种恶性肿瘤，如食管癌、上喉癌、肺癌、口腔癌、胃癌等的发生密切相关。
迄今为止，已报道的单核苷酸多态性位点检测的方法有多种，包括PCR产物限制性酶切片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）、DNA直接测序、高分辨率溶解曲线（high resolution melting，HRM）和基因芯片技术等，但这些方法步骤多、耗时长、要求高，难以用于临床常规检测。realtime ASA PCR具有较高的敏感性和特异性，耗时短，操作简便，无需开盖操作，可减少实验室污染，已普遍在临床实验室常规开展。本研究比较了real-time ASA PCR和DNA测序法检测ALDH2等位基因的结果，2种方法总符合率为98.9%（371/375），一致性好。对结果不一致的4例标本用基因芯片法复检，结果与PCR荧光法完全一致。分析结果不一致的原因可能是：real-time ASA PCR和基因芯片法灵敏度极高，导致不完全特异扩增；或测序结果分析时将杂合子中峰值较低的碱基判断为背景得到纯合子结果，或测序前电泳回收时发生污染。此情况可通过重新检测纠正错误。
本研究共检测了375例患者ALDH2基因1510位点核苷酸多态性，结果显示人群中低活性的ALDH2*1/*2约占28. 5%～28. 8%，无活性的ALDH2*2/*2约占5.4%～5.6%，即无活性的ALDH2*2等位基因存在于大约33.9%～34.4%的中国人群中。由于ALDH2基因多态性与民族及地域相关，此前国内一项研究表明北京地区汉族人群的杂合突变和纯合突变分别为20%和1%[11]。本研究未对民族和患者居住地进行相关分析，这或许是结果存在差异的原因。另有研究表明，不同人种之间ALDH2等位基因频率分布存在明显差异，ALDH2*2突变等位基因被发现于约30%～50%的黄种人中，而在白种人和黑种人中则基本缺乏。ALDH2*2突变等位基因使ALDH2活性减弱甚至丧失，从而影响其代谢的酒精氧化过程和硝酸甘油的药效。此外，有研究报道，ALDH2*2突变等位基因是冠心病的危险因素，也与多种恶性肿瘤的发生密切相关[5-9，12-15]。由此可见，ALDH2*2突变等位基因与多种物质代谢和疾病相关。由于黄种人群中ALDH2*2突变等位基因所占比例高，了解是否为突变基因携带者，对患者的个体化治疗和诊疗多种疾病具有重要的临床指导意义。
本研究也存在一些不足，由于受试人群是随机选取的住院患者，无法追踪酒精和/或硝酸甘油的代谢情况。因此，进一步的实验研究将有针对性的选取受试人群，根据其饮酒和用药情况，判断ALDH2不同基因型对酒精和硝酸甘油代谢的影响。
综上所述，本研究显示ALDH2*2突变等位基因在中国人群中比例较高（33.9%～34.4%），临床实验室可常规开展ALDH2基因型检测，用以评估ALDH2不同基因型对酒精和硝酸甘油代谢的影响。real-time ASA PCR具有较高的敏感性和特异性，简便可靠，可满足临床对ALDH2基因型检测的要求。
摘选自：360个人图书馆
作者：孙宇晶等
