F10基因Val298Met纯合突变导致的重型遗传性凝血因子X缺陷症家系分析
作者：金艳慧 郝秀萍 程晓丽 杨丽红 陈怡 谢海啸 王莹宇 王明山
选自：中华医学遗传学杂志, 2016,36(03): 296-299.
遗传性凝血因子Ⅹ(coagulation factor Ⅹ，FⅩ)缺陷症是由位于人类染色体13q34的 F10基因突变所致的一种罕见常染色体隐性遗传性疾病，在一般人群中纯合子发病率1∶1 000 000，临床表现为不同程度的出血倾向[1]。研究表明，遗传性FⅩ缺陷症的临床表型具有异质性，其临床表型与等位基因突变的数量、突变位点对功能的影响程度及基因多态性等密切相关[2,3]。因此，鉴定基因突变类型对FⅩ缺乏症患者的临床诊断和治疗具有重要意义。本研究中我们对1个由近亲婚配引起纯合突变的遗传性FⅩ缺陷症家系成员进行凝血指标与基因水平的分析，探讨其突变基因型与表型的关系。
1 对象与方法
1.1 对象
遗传性FⅩ缺陷症家系来自江西省新余市(图1)。先证者(Ⅲ1)，女，28岁，2013年7月因"左腿、左膝关节肿痛"来我院急诊就诊。检查发现凝血酶原时间(prothrombin time，PT)为67.2 s，活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time，APTT)为102.9 s，FⅩ活性(FⅩ activity，FⅩ∶C)和FⅩ抗原(FⅩ antigen，FⅩ∶Ag)分别为1%和8%，肝肾功能正常。先证者9岁时出现双膝关节肿大，未查明病因；2009年因"左大腿肿胀痛"就诊于上海交通大学附属瑞金医院，确诊为"凝血因子X缺陷症" ，予输冰冻血浆后明显好转；既往有皮下淤青和月经量明显增多等症状，有3次输血史，其父母为姑表近亲婚配，其他家系成员均无自发出血症状。
图1
遗传性凝血因子X缺陷症家系图
120名正常健康体检者作为凝血表型指标对照，其中男性66名、女性54名，平均年龄34岁(24～55岁)。均无肝肾功能疾病，无血栓或出血史。经知情同意后，抽取家系成员及正常对照体检者血样。
1.2 方法
1.2.1 引物
根据 F10基因序列(GenBank AF503510)，应用Primer Premier 5.0™软件设计9对引物以覆盖 F10基因的所有外显子及侧翼、5′和3′非翻译区序列(引物序列由上海交通大学附属瑞金医院王学锋教授馈赠)引物序列见参考文献[4]。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。
1.2.2 样本采集及处理
抽取患者及其家系成员的外周静脉血样各2份以0.109 mol/L枸橼酸钠1∶9抗凝，一份离心后上层血浆用于各项凝血指标的检测；另一份用于DNA提取，在－40℃冰箱保存，用于PCR扩增。
1.2.3 血浆凝血指标检测
PT、APTT、纤维蛋白原(fibrinogen，FIB)、FⅩ∶C、因子Ⅶ活性(factor Ⅶ activity，FⅦ∶C)、因子Ⅱ活性(factor Ⅱ activity，FⅡ∶C)、因子Ⅴ活性(factor Ⅴ activity，FⅤ∶C)等凝血指标用一期凝固法在STAGO STA-R全自动血凝仪上测定。FⅩ∶Ag采用ELISA法检测。
1.2.4 外周血基因组DNA提取
应用酚-氯仿法抽提先证者及家系成员外周血基因组DNA，应用核酸蛋白分析仪DU800检测基因组DNA的浓度和纯度。
1.2.5 PCR扩增及电泳
PCR试剂为2×Taq PCR MasterMix(含染料)。PCR反应总体积为50 μL，包括PCR扩增预混合溶液(Taq PCR MasterMix)、DNA模板、引物对和双蒸水。扩增产物用12 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.6 DNA测序分析
PCR产物割胶后送上海桑尼生物工程有限公司纯化后测序，所用测序仪为ABI PRISM 3730。用Chromas软件将测序结果与美国NCBI GenBank所公布的 F10基因序列AF503510进行比对，找寻基因突变，并对含有基因突变的序列进行反向测序确认。先扩增先证者F10所有外显子及侧翼序列，家系成员DNA则仅在先证者 F10基因突变位点的相应外显子片段序列扩增后进行测序。
1.2.7 蛋白质生物学特性分析
用CLC Genomics Workbench 7.5软件对g.27881G>A(p.Val298Met)突变的生物结构进行分析，并与正常FⅩ蛋白比较，推测基因突变影响FⅩ蛋白功能的可能机制。
2 结果
2.1 家系成员表型及凝血指标结果
先证者PT和APTT均明显延长，FⅩ∶C和FⅩ∶Ag明显减低；先证者父亲、母亲和弟弟的PT稍延长，FⅩ∶C和FⅩ∶Ag均约为正常对照的一半；先证者妹妹各项指标及家庭成员其他凝血指标均无明显异常，见表1。
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表1 先证者及家系成员主要实验表型及基因分析结果 |
2.2 F10基因突变分析结果
先证者存在 F10基因第8外显子g.27881G>A纯合突变，导致p.Val298Met错义突变；先证者父亲、母亲和弟弟均存在 F10基因第8外显子g.27881G>A杂合突变，妹妹 F10基因为正常野生型，见表1、图2。从家系图分析推测先证者的g.27881G>A纯合突变分别遗传自近亲婚配的父母。F10基因的其它外显子及侧翼、5′和3′非翻译区的测序未发现突变。
图2
遗传性FⅩ缺陷症家系 F10基因第8外显子的测序结果 2A：先证者，g.27881G>A纯合突变；2B：先证者弟弟，g.27881G>A杂合突变；2C：先证者妹妹，g.27881G野生纯合型
图3
FⅩ的Val298突变前后蛋白二级结构分析 3A：FⅩ发生Val298Met突变；3B: F10基因参考序列AF503510
2.3 蛋白质生物学特性分析
2.3.1 保守性分析
将FⅩ与丝氨酸蛋白酶家族中的FⅦ、因子Ⅸ活性(factor Ⅸ activity，FⅨ∶C)、FⅡ和蛋白C(protein C，PC)、蛋白S(protein S，PS)等几种同源蛋白序列比对分析发现，第298位缬氨酸(Val298)在这些蛋白间并不保守，FⅡ、PC、PS的同源氨基酸残基分别为异亮氨酸(I)、异亮氨酸(I)和脯氨酸(P)。但FⅩ的Val298在不同物种间(黑猩猩、猕猴、家犬、小家鼠、褐家鼠、家兔、牛和原鸡)同源序列的比对具有高度保守性。
2.3.2 蛋白二级结构分析
p．Val298Met突变使第274～280位及第332～336位氨基酸的二级结构发生改变：正常FⅩ蛋白的第274～280位氨基酸(AAHCLYQ)由α螺旋(AAH)、β折叠(C)和α螺旋(LYQ)组成，发生突变后第274～279位氨基酸(AAHCLY)形成α螺旋结构；第332～336位氨基酸(ITFRM)形成的β折叠结构突变后发生改变(由ITFR组成)，见图3。
3 讨论
凝血因子X是一种肝脏合成的维生素K依赖性丝氨酸蛋白酶，在凝血过程中转变为FⅩa后，与激活的FⅤ、Ca2＋、磷脂酰丝氨酸形成凝血酶原酶，共同激活凝血酶原为凝血酶，促进凝血酶的生成[5]。遗传性FⅩ缺陷症通常由 F10基因突变所致，已报道的 F10基因突变共约100余种，其中错义突变占80%以上，无义突变、剪切位点突变、缺失突变和插入突变较少见(http：//c.ymcdn.com/sites/www.isth.org/resource/resmgr/ publications/fx_mutations-2011.pdf)。该病一般分为两种表型：FⅩ活性和抗原含量同时减低的交叉反应物质阴性(CRM－，Ⅰ型)和FⅩ活性下降，但抗原含量多为正常的CRM＋(Ⅱ型)。此外，也有将FⅩ活性和抗原均减低、但活性又显著低于抗原的称为CRMRed(CRMR)[4,6]。本文研究的遗传性FⅩ缺陷症家系中先证者自幼即有出血倾向，PT、APTT均显著延长，FⅩ∶C和FⅩ∶Ag含量明显降低，其他凝血指标检测均正常，故诊断为FⅩ缺陷症；通过先证者及家系成员的基因突变分析发现，先证者存在 F10基因第8外显子g.27881G>A纯合突变导致p.Val298Met错义突变，其父亲、母亲和弟弟均为g.27881G>A突变杂合子，妹妹 F10基因为正常野生型；从家系分析推测先证者g.27881G>A纯合突变分别遗传自姑表近亲婚配的父母，且该突变是导致Ⅰ型遗传性FⅩ缺陷症的分子基础。
我们通过对FⅩ的Val298在不同物种间同源序列比对发现其具有高度保守性，但与凝血系统中几种高度同源的丝氨酸蛋白酶比对发现该位点在这些蛋白间并不保守。由于催化区结构域均具糜蛋白酶活性，催化反应的底物不同，显示该位点具有很强的特异性。从二级结构分析发现Met代替Val后，第274～280位氨基酸形成的α螺旋(AAH)、β折叠(C)和α螺旋(LYQ)结构，突变后形成由第274～279位氨基酸组成的α螺旋结构；第332～336位氨基酸(ITFRM)形成的β折叠结构，突变后发生改变(由ITFR组成)。2000年Millar等[2]报道Val298位于结构上高度保守的CR5区，尽管位于FⅩ结构保守区的298位Val被Met替代后不影响蛋白质亲水性，但具有大侧链的Met取代Val可影响蛋白质局部空间相互作用，引起蛋白错误折叠，从而导致蛋白质的合成或分泌障碍、血浆中的FⅩ∶C及FⅩ∶Ag均降低，表现为CRM－。本研究家系中存在纯合突变的先证者，其血浆中FⅩ含量明显减少，使FⅩ∶C极度减低至1%，导致患者凝血功能显著异常而表现为重度出血症状；先证者父亲、母亲和弟弟为Val298Met杂合子，血浆中FⅩ含量和活性均占正常人一半左右，故其凝血功能基本正常，临床上均无自发出血症状。因此，推测FⅩ的Val298位点与FⅩ功能的特异性密切相关，Val298Met通过影响FⅩ蛋白局部空间结构，导致FⅩ合成分泌障碍而使血浆中FⅩ凝血活性降低，具体机制有待进一步研究。
遗传性外源凝血系统凝血因子缺陷症患者，通常存在纯合或复合杂合突变临床出血表现较严重，单个杂合突变常无明显临床出血症状[2,3,4,5,6,7,8,9,10,11]。检索 F10基因突变数据库和相关文献，发现存在Val298Met纯合或复合杂合突变患者临床上均表现为中、重度出血症状[2,3,6,7]，但Herrmann等[3]报道的先证者为Val298Met单个杂合突变，表现为无症状。本例先证者存在Val298Met纯合错义突变，表现为自幼出血症状，左腿和左膝关节因出血后血肿而无法行走，需输冰冻血浆缓解症状；存在Val298Met单个杂合突变的家系成员均无自发出血症状。由此可见，Val298位点对FⅩ的凝血功能具有重要意义，Val298Met突变是导致该先证者FⅩ缺陷症的分子发病机制。
