中科院神经所杨辉等课题组设计出更高效精确的基因靶向整合新策略

2017-06-05 08:37:39科研小助手

《Cell Research》期刊在线发表了题为《Homology-mediated end joining-based targeted integration using CRISPR/Cas9》的研究论文，该项工作由博士研究生姚璇、王兴、刘真与研究实习员胡新德在灵长类疾病模型研究组研究员杨辉、基因编辑平台主任施霖宇与苏州非人灵长类研究平台主任孙强的指导下完成，课题组的其他成员积极参与，并得到了神经所研究员程乐平、上海科技大学研究员黄鹏羽的大力协助，是众多课题组通力合作的重要成果。该研究设计了一种以同源臂介导的末端接合（Homology-Mediated End Joining, HMEJ）为基础的基因敲入策略，它在很多种系统（体外培养的细胞、动物胚胎和体内组织）中比现有的基因敲入策略的效率都要高。基于更高效的编辑效率和更好的精确度，HMEJ介导的基因敲入方法为一系列应用，包括基因编辑动物模型的建立、疾病的靶向基因治疗等提供了非常大的应用前景。

在体外使用基于HMEJ的方法进行基因组编辑

作者首先想要看一下基于HMEJ（同源臂末端连接）的方法是否比基于HR（同源重组）、NHEJ（非同源末端连接）和MMEJ（微同源末端连接）的CRISPR/Cas9的效率会好，所以设计了四组实验来检测敲入的效率：HMEJ（sgRNA靶点序列+800 bp的同源臂）、HR（只有同源臂）、NHEJ（只有sgRNA的靶点序列）和MMEJ（sgRNA靶点序列+20 bp的同源臂）（Fig. 1）。

为了评估敲入的效率，作者打算在胚胎干细胞（Embryonic stem cells, ES cells）Actb基因最后的密码子之后敲入一个p2A-mCherry（注：红色荧光蛋白，p2A是一个可以发生自剪切的多肽）报告基因。最终的结果以mCherry⁺细胞的百分比来呈现敲入的效率（Fig. 2A&B）。

在小鼠ES细胞中转入供体/sgRNA质粒7天后，敲入效率如下：HMEJ-based method(7.54% ± 0.37%) ，与HR-based method (7.55% ± 0.22%)相似，但是比MMEJ-based method (1.14% ± 0.16%) 和NHEJ-based method (0.21% ± 0.04%)都要高（Fig. 2C）。之后作者又使用了不同大小的片段（0.7 kb~6.1 kb）敲入到不同的位点（Tubb3, Rosa26, Sox2和Nanog），其趋势也类似（Fig. 2C&D）。

另外，在小鼠来源的神经瘤母细胞N2a细胞的Actb，Tubb3和Rosa26位点处测试了敲入的效率，同样发现HR和HMEJ方法有更高的敲入效率（Fig. 2E）。在HEK293T细胞的纤维蛋白基因（fibrillarin，FBL）最后一个密码子之后使用四种方法敲入了p2A-mCherry，结果发现HMEJ方法敲入效率明显高于其他三种方法（Fig. 2F）。

随后检测了同源臂（HA）的长度是否会影响HMEJ的敲入效率，结果发现800和1600 bp长度的同源臂有更高的效率（Fig. S3），考虑到内源应用和质粒构建的局限性，作者选择了800 bp的长度做后续实验。

在原代星形胶质细胞和神经元细胞中检测上述四种方法的效率，发现HR供体敲入的细胞数量非常少，而其他三种方法都可以有效敲入，基因组鉴定结果显示，HMEJ在神经元细胞中可以精确的敲入基因片段（Fig. 2G）。

以上结果表明，与HR供体方法相比，HMEJ供体的方法可以在小鼠ES细胞和N2a细胞中有效的敲入基因，而在HEK293T、原代星形胶质细胞和神经元细胞中则有着更高的敲入效率。

使用HMEJ方法在小鼠和猴子的胚胎中进行基因组编辑

为了检测HMEJ方法能否在产生基因修饰小鼠方面提高基因的敲入效率，作者又向小鼠的受精卵中注射了Cas9 mRNA、靶向Actb基因的sgRNA和HMEJ供体（Fig. 3A）。

这些受精卵培养至囊胚期然后通过检测mCherry荧光信号来评估敲入效率。结果发现HMEJ供体效率（22.7%）明显高于MMEJ供体（11.9%）、HR供体（3.3%）或者NHEJ供体（1.4%）的敲入效率（Fig. 3B, C）。另外基因组鉴定发现HMEJ和MMEJ方法都可以精确的敲入基因片段，而NHEJ不仅敲入效率比较低而且会引起接口处发生缺失。另外作者还检测了HMEJ介导的其他位点（Nanog『多能性Marker』、Sox2『多能性Marker』和Cdx2『滋养外胚层Marker』）的敲入情况。结果发现HMEJ方法的敲入效率最高（Fig. 3B, C）。而且从表达情况来看，在mCherry⁺细胞中，Nanog和Sox2敲入体都严格表达在内细胞团中（inner cell mass, ICM），而Cdx2则在滋养外胚层中表达，说明基因片段有正确敲入（Fig. 3B）。

接下来作者又靶向多巴胺-β-羟化酶（dopamine beta-hydroxylase, Dbh『神经元表达酪氨酸羟化酶』）和Sox2基因评估了HMEJ方法产生基因修饰小鼠的情况。把基因编辑过的胚胎移植入假孕小鼠中，发现HMEJ方法编辑的胚胎出生率正常，且获得敲入小鼠的效率为：Dhh（12.1%）和Sox2（26.9%），这比HR和MMEJ方法要高（Fig. 3D）。

Dbh敲入小鼠脑部组织的免疫荧光显示，mCherry特异性的在TH⁺神经元细胞中表达，这说明基因被正确的敲入了（Fig. 3E）。以上结果表明在产生基因修饰小鼠方面，HMEJ方法可以更高效地进行DNA整合。

在猴子胚胎中由于DNA的切割效率很低，所以迄今为止还未有报道在猴子中成功敲入基因的案例。因此作者又检测了HMEJ防范是否能有效的在猴子中敲入基因。作者旨在将Actb-intron 4-exon 5-2A-mCherry敲入到Actb的4号内含子处，这样就可以由Actb的启动子控制mCherry的表达（Fig. 4A）。第一次的时候作者在26个胚胎细胞中注射了浓度为100 ng/μl的HMEJ供体质粒，结果在5个囊胚中获得了4个mCherry⁺的囊胚。之后作者又注射了浓度为50 ng/μl的HMEJ供体，结果在4个囊胚中获得了1个mCherry⁺的囊胚。所以作者总共在9个囊胚中获得了5个mCherry⁺的囊胚（Fig. 4B, C）。

通过PCR扩增整合的接口处，发现在所有注射的36个胚胎中，29个5’接口是阳性的，25个3’接口是阳性的，24个两个接口均是阳性的（Fig. 4D, E）。

以上PCR产物测序发现大部分都可以进行精确的整合（5’端为25个PCR产物中的24个，3’端为18个PCR产物均正确）（Fig. 4F）。因此，HMEJ可以作为猴子中有效的敲入方法。

HMEJ方法在体内基因组编辑的应用

之前的报道表明，被广泛应用的HR方法进行体内组织的基因组编辑效率非常低。因此作者检测了HMEJ方法在此方面是否更有优势。首先通过子宫穿孔技术（in utero electroporation）将Actb-HMEJ注入E14.5（胚胎期第14.5天）的小鼠大脑内（Fig. 5A）。七天后，对小鼠的大脑进行切片染色和计数，发现其中10.0% ± 0.7%的电穿孔细胞（mCherry⁺/GFP⁺）会表达mCherry（Fig. 5B,C）。然而使用HR、NHEJ和MMEJ供体的只有0.8% ± 0.2%、1.3% ±0.1% 和3.6% ± 0.2%是mCherry⁺。之后通过尾静脉注射将HR、NHEJ、MMEJ和HMEJ供体注入到小鼠的肝脏中，七天后肝细胞中分别只有4.5% ± 0.5%、17.4% ± 1.3%、18.0% ± 1.7% 和48.0% ± 2.9%（mCherry⁺/GFP⁺）表达了mCherry（Fig. 5D-F）。

为了更方便的在体内应用，还测试了是否可以用腺相关病毒（AAV）将Cas9和sgRNA/HMEJ供体导入体内即可达到上述效果。在将HMEJ-AAVs注射入成年小鼠的视觉皮层（V1）三周后进行了大脑切片染色和计数（Fig. 5G, H）。与未被感染的细胞相比，52.8% ± 11.3%的GFP⁺细胞是mCherry⁺的并且大部分可以与NeuN（神经元的Marker）共定位。这说明HMEJ介导的靶标整合同样在非分裂细胞中有效（Fig. 5I, J）。

以上结果表明在体内基因整合方面HMEJ方法要比HR、NHEJ和MMEJ更高效。

HMEJ方法的机理

最后，作者研究了HMEJ方法是否依赖于HMEJ和HR通路（Fig. 1）。在小鼠胚胎干细胞和原代神经元中转染了不同的p2A-mCherry供体，并且同时用NHEJ抑制剂（Scr7或Nu7026）和HR抑制剂（caffeine，一种HR通路中的ATM和ATR激酶的非特异性抑制剂）处理（Fig. 6A, B）。与之前的报道一致，在小鼠胚胎干细胞和神经元细胞中，NHEJ抑制剂和HR抑制剂分别阻碍和促进了NHEJ介导的敲入。更有意思的是，HR抑制剂在小鼠胚胎干细胞中阻碍了MMEJ介导的敲入但是在神经元细胞中却促进了MMEJ介导的敲入（Fig. 6A, B）。而对于HMEJ，结果发现在小鼠胚胎干细胞中HR抑制剂可以有效减少HMEJ介导的敲入但是在神经元中则没有效果。而NHEJ抑制剂可以明显减少神经元中HMEJ介导的敲入但在小鼠胚胎干细胞中则无效。在小鼠胚胎干细胞中，HMEJ方法与HR方法效率比较接近，而在原代神经元中，HMEJ与NHEJ和MMEJ方法敲入效率比较接近。

以上结果表明HMEJ方法在小鼠胚胎干细胞中主要通过HR通路，并且NHEJ抑制剂在原代神经元中可以影响HMEJ通路（Fig. 6C）。基于之前小鼠ES细胞和N2a细胞之间以及原代神经元和星形胶质细胞之间相似的敲入效率，作者推测在N2a细胞中HMEJ是通过HR通路，在原代星形胶质细胞中则是通过HMEJ通路。考虑到在小鼠胚胎干细胞、HEK293T、体内细胞和最近报道的人源多功能干细胞中HMEJ方法相比其他三种方法有着更高的敲入效率，作者推测在这些细胞中HMEJ是通过HR和HMEJ两种通路起作用的。