内容提要

    本书共分三个部分，分别是临床基因扩增实验室的设计部分、基因扩增实验室的施工及验收部分和设计施工的附录部分。其中设计部分包括：临床基因扩增实验室的定义和条件、临床基因扩增设计思路与要点；施工与验收部分包括：基因检验实验室装饰的施工与验收、基因检测实验室风系统的施工与验收、基因扩增实验实验室水系统的施工与验收、基因扩增实验室配电系统施工与验收、自动控制系统的施工与验收、实验室设备安装及验收、基因扩增实验室的工程验收等；附录部分包括：实验室围护结构严密性检测和排风HEPA过滤器检漏方法指南、生物安全实验室良好工作行为指南、实验室生物危险物质溢洒处理指南、卫生部办公厅关于印发《医疗机构临床基因扩增管理办法》的通知、实验室认可指南等。

    为满足从事或即将从事基因扩增实验室设计、施工和管理人员的需要，在书中编人了大量的、实用的有关基因扩增实验室的设计、施工、运行管理方面的经验、资料和数据。同时本书也可给相关专业的学生提供一定的指导。

 

 

 第一部分  临床基因扩增实验室设计

 

    临床基因扩增实验室主要包含四个核心实验区，即试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区，这四个区域各自独立，空气流向只能是单向流，不能出现空气交叉流动。临床基因扩增实验室的设计参考规范主要是《实验室 生物安全通用要求 GB 19489》、《生物安全实验室建筑技术规范GB 50346》、《基因检验实验室技术要求SNT 1193》、《实验室生物安全手册》以及《微生物和生物医学实验室 生物安全通用准则WS 233》等，根据这些规范的要求，结合临床实验现状，我们对临床基因扩增实验室进行了系统的分析和设计，能对从事或即将从事基因扩增实验室设计、施工和管理人员提供一定的支持。

 

第一章 临床基因扩增实验室的定义和条件

一 临床基因扩增实验室定义

  根据《中华人民共和国出入境检验检疫行业标准》SN/T 1193的规定，临床基因扩增实验室主要指 PCR实验室。PCR是聚合酶链式反应(PolymeraseChainReaction)的简称。聚合酶链式反应也可以当作一项极其重要的酶促合成DNA技术。临床基因扩增又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。

  DNA聚合酶（DNApolymeraseI）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性，因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase)，则是于1976年从温泉中的细菌（Thermusaquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。多次循环后的TaqDNA聚合酶仍然具有活性，因此反应体系自动往复多次地进行对所需的DNA的片段的酶促合成，使反应产物按指数增长，所以命名为聚合酶链式反应。

  临床基因扩增最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似临床基因扩增前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的临床基因扩增则于1983由Dr.KaryMullis发展出的，Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式发表了第一篇相关的论文。随后临床基因扩增技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

    临床基因扩增的反应原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。临床基因扩增由变性---退火---延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时聚合酶链式反应间后，使模板DNA双链或经临床基因扩增扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

  如此重复改变反应温度，即高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环，每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍，一般样品是经过30次循环，最终使基因放大了数百万倍；将扩增产物进行电泳，经溴化乙锭染色，在紫外灯照射下肉眼能见到扩增特异区段的DNA带。

    标准的临床基因扩增过程分为三步： 　　

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA； 　　

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链； 　　

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链。每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

    现在有些临床基因扩增因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

 

                     

 

    参加临床基因扩增反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ 　　

引物

    引物是临床基因扩增特异性反应的关键，临床基因扩增产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用临床基因扩增就可将模板DNA在体外大量扩增。 　　

酶及其浓度

    目前有两种Taq DNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的临床基因扩增反应约需酶量2.5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。 　　

dNTP的质量与浓度　

    dNTP的质量与浓度和临床基因扩增扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCL的缓冲液将其PH调节到7.0～7.5，小量分装，-20℃冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在临床基因扩增反应中，dNTP应为50～200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等(等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时(偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低临床基因扩增产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。 　　

模板(靶基因)核酸　

    模板核酸的量与纯化程度，是临床基因扩增成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于临床基因扩增反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于临床基因扩增扩增。RNA模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 　　

Mg2+浓度

    Mg2+对临床基因扩增扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的临床基因扩增反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。

                      

 

 

二 临床基因扩增实验室具备的条件

   根据《医疗机构管理条例》、《医疗机构临床实验室管理办法》、《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》、《2015分子生物学实验室建设指南》试行中对临床扩增实验室的要求实验室建设需具备的条件如下：

①　必须拥有标准的的临床基因扩增荧光实验室；

实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了临床基因扩增从定性到定量的飞跃，而且与常规临床基因扩增相比，它有特异性更强、有效解决临床基因扩增污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。

②　检测设备必须符合标准临床基因扩增荧光实验室设置要求；

荧光定量PCR仪+实时荧光定量试剂+通用电脑+自动分析软件，构成PCR-DNA/RNA实时荧光定量检测系统。

③　临床基因扩增实验室工作人员均应经过有资质的培训机构培训合格，并取得上岗证后方可上岗。

④　实验室不得使用非本单位技术人员从事相关检测工作。

⑤　实验室负责人应具有临床医学和病理专业背景、具有分子生物学相关工作经历、具有副主任医师以上专业技术职称、从事本专业的本单位在职医师，主要职责是监督实验室运行、实施质量控制、开展新项目等。

⑥　授权签字人应是取得临床病理学和/或遗传学《执业医师资格证书》、具有中级或以上专业技术职称、从事本专业的本单位在职医师或技术人员。

⑦　分子病理技术员应具备病理学、分子生物学的基本知识，大专以上学历，并进行过相关专业技术的技能培训或进修学习，获得相应的上岗资格证书。

⑧　对实验室工作人员应制定工作能力评审的内容和方法，每年评审，对新进工作人员在最初6个月内应至少进行2次能力评审，保存评审记录。当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对相关工作人员进行再培训和再评审。合格后才可继续上岗，并记录。

依据卫计委临检中心管理文件《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》获得政府批准，基于NGS技术的所有临床检测必须遵循文件中的相关规定。实验室应该建立标准操作程序（SOP）、遵守所有的质控（QC）标准、记录每个检测的性能。按照SOP和QC标准，NGS流程应该在每个实验室中达到预期运行特性。内部质控和外部质控评估（EQA）对于实验室评估NGS结果也是必不可少的。

 

第二章 临床基因扩增设计思路与要点

一 临床基因扩增实验室布局形式

A、功能区呈现分散形式

这种实验室往往都是由于场地受限，不得不将各个功能区分散于不同的建筑物或者同一建筑物的不同位置，各功能区之间没有相邻，互不干扰，对于这种的临床基因扩增实验室一般来说没有特定的要求。但由于这种功能间之间的分散性给实验人员带来诸多不便，所以在新建的临床基因扩增实验室往往不采用这种这种形式。

B、组合形式临床基因扩增实验室

组合形式临床基因扩增实验室是目前最为常见的新增临床基因扩增实验室的建设形式，由于建设所提供的空间比较大，可以将各功能区实验用房能够依次相邻划分，形成一个组合形式完成基因扩增分析的临床基因扩增实验室，各个功能区的实验室在空间分布上各自独立，互不干扰，彼此之间除了传递窗不存在任何交互。但是由于这些功能间都在一个区域范围内，所以对于组合形式临床基因扩增实验室必须提供安全保证的屏障系统，各室在入口处设缓冲间，以减少室内外空气交换。同时也要考虑整个实验室的人流路线、物流路线以及消防路线等，另外也要对实验室的空调通风系统、气流流向、大气压以及装修材料等提出了一定的要求。

工作区域及各区域所用的仪器设备必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用。各区域实验台表面应可耐受次氯酸钠、双氧水等化学物质及紫外线的消毒清洁作用。

临床基因扩增实验室可分为两个大的功能工作区域：核酸扩增前区和核酸扩增后区。核算扩增前区包括试剂准备间和样本制备间，这个两房间各自独立，不能出现空气互通，这两个房间相对外界气压呈正压状态。核酸扩增后区包括扩增区和产物分析区，使用实时荧光临床基因扩增仪、HIV病毒载量测定仪的临床基因扩增实验室，这个两区域可以合并为一个房间。这个区域如果是分开两个房间，这两个房间也必须是各自独立，不能出现空气互通。核算扩增后区对外界气压呈负压状态。

‚临床基因扩增实验室根据使用仪器的功能合理设置各个工作区域，如采用聚合酶联反应：则设置试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区四个单独的工作区域，这是最常用的分区方式。样品需要粉碎处理的，还需增设样品粉碎区；若使用实时荧光临床基因扩增法：基因扩增区、基因产物分析区可以合并在一个房间内；采用标本处理、核酸提取及扩增检测为一体的全自动化临床基因扩增分析仪，则标本制备区、扩增区、扩增产物分析区可合并为一个区域，因此临床基因扩增实验室原则上设置五个区或四个区或三个区或二个单独的工作区。

ƒ核酸扩增前区和核酸扩增后区可设在一个房间内，但必须在满足下列要求的前提下：

核酸扩增前区实验室内设置两个不同位置的实验区，试剂配置在超净工作台中操作，样品处理在生物安全柜内操作。

在核酸扩增后区使用全封闭的扩增和检测系统，如实时荧光临床基因扩增仪等。

每个实验人员使用各自的试剂、耗材、移液器和盛放污染物的盛器。

在实验前后对操作区域和共享器具进行清洁及消毒。

各区域的试剂、器具、仪器和设备为该区专用，不得交叉使用。

二 分区设置

（1）试剂储存和准备区

该实验区主要进行的操作为贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。试剂和用于样品制作的材料应直接运送至该区，不得经过其他区域。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。对与气流压力的控制，本区应对外界保持微正压。

（2） 标本制备区

该区域主要进行的操作为样本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定DNA的合成。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为正压，以避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免在本区内不必要的走动。

（3）扩增反应混合物配制和扩增区

该区域主要进行的操作为DNA扩增和扩增片段的测定。此外，已制备的DNA模板(来自样本制备区)的加入和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。个别操作如加样等应在超净台内进行。

三 临床基因扩增实验室工作基本原则

进入各工作区域应当严格按照单一方向进行，即试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区。

各工作区域必须有明确的标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用，最好能用不同颜色的地面作为区别。

不同的工作区域使用不同的工作服（例如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不得将工作服带出。

各区域要有醒目的标示牌，防止出现混乱。

（5）实验室的清洁应当按试剂贮存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

    （6）工作结束后，必须立即对工作区进行清洁。工作区的实验台表面应当可耐受诸如次氯酸钠的化学物质的消毒清洁作用。实验台表面的紫外照射应当方便有效。由于紫外照射的距离和能量对去污染的效果非常关键，因此可使用可移动紫外灯（254nm波长），在工作完成后调至实验台上60～90cm内照射。由于扩增产物仅几百或几十碱基对（bp），对紫外线损伤不敏感，因此紫外照射扩增片段必须延长照射时间，最好是照射过夜。

实验室的安全工作制度或安全标准操作程序，所有操作符合《实验室生物安全通用要求》。

四 临床基因扩增实验室各区域工作注意事项

(1)试剂储存和准备区

    本区的功能为：贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。

    贮存试剂和用于样品制备的材料应直接运送至试剂贮存和准备区，不能经过产物分析区。试剂原材料必须贮存在本区内，并在本区内制备成所需的贮存试剂。当贮存试剂溶液经检查可用后，应将其分装贮存备用。

    大多数用于扩增的试剂都应冰冻贮存。主贮存试剂，应分装冰冻贮存。贮存试剂的分装体积根据通常在实验室内一次测定所需的扩增反应数来决定。

主反应混合液的组成成分尤其是聚合酶的适用性和稳定性通过预试验来检查，评价结果必须有书面报告。对于“热启动”技术，聚合酶也可不包含在主反应混合液中。

（2）样品粉碎区（根据实际需要增设）

    本区的功能为：对样品进行粉碎。

    样品在此区粉碎，转移到样品处理容器并加人适当核酸抽提溶液后，再进入样品制备区。

    已粉碎好的样品，在此区抽取所需检测用的试样，转移到样品处理容器并加人适当核酸抽提溶液后，再进人样品制备区。将其余样品封存后送回样品制备区。

    粉碎机要放置在排气的防污染操作台上，每个样品要单独使用已彻底清洗过的器皿。

粉碎要在单独的房间进行，并且要远离其他操作区域。

（3）样品制备区

    本区的功能为：待检样品的保存，核酸提取、贮存及其加人至扩增反应管。

    样本处理对核酸扩增有很大影响，必须使用有效的核酸提取方法，可在开展检测前对提取方法进行评价。制备好的样品核酸要贮藏在超低温冰箱中。

    本区可部分或全部设为正压条件。从试剂贮存和准备区拿来的主反应混合液，在此区正压条件下加人待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管，再进人反应扩增区。

    （4）扩增区

    本区的功能为：DNA扩增。此外，已制备的DNA模板的加人和主反应混合液(来自试剂贮存和制备区)制备成反应混合液等也可在本区内进行。在巢式PCR测定中，通常在第一轮扩增后必须打开反应管，因此巢式扩增有较高的污染危险性，第二次加样必须在本区内进行。

    （5）扩增产物分析区

    本区的功能为：扩增片段的测定。

    核酸扩增后产物的分析方法多种多样，如膜上或微孔板上探针杂交方法(同位素标记或非同位素标记)、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酞胺凝胶电泳、Southern杂交、核酸测序方法等。

    在使用PCR-ELISA方法检测扩增产物时，必须使用洗板机洗板。

    本区是最主要的扩增产物污染来源，本区如采用负压条件或减压情况下(如安装排风扇)可减少扩增产物从本区扩散至前面区域的可能性。

由于本区有可能会用到某些可致基因突变和有毒物质如溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或放射性核素等，故应当注意实验人员的安全防护。

安全注意问题

1) 生物安全柜的摆放位置不易摆放在与出入口紧邻的墙体上；

2) 实验室内的通讯设施应该放置于生物安全柜对面；

3) 实验室门口位置设置紧急洗眼器和紧急喷淋，以防止实验人员受到伤害；

4) 高压灭菌器应与传递窗紧邻；

5) 实验室内的压力显示器和报警装置都应放置在醒目位置；

6) 与室外联系的电话应放置在醒目位置，并且放置在便于实验室人员快速拿起的位置；

7)  实验室应该具有防止昆虫和其他动物进入的措施。

五 空间布局

1.室内净高

    临床基因扩增实验室和研究工作室的室内净高：当不设置空气调节时，建议不宜低于2.7m，一般为2.7m—2.9m；设置空气调节时，不应低于2.4m，一般为2.4m—2.6m。走道净高不应低于2.2m。

2.面积

    临床基因扩增实验室各个房间的面积并没有严格要求，但是生物安全柜房间建议不能低于10平米，一般为15平米以上，并且每增加一台生物安全柜，房间建议增加10平米。样本间的面积相比其他房间要稍大一些。

3.窗

    临床基因扩增实验室外窗应具有良好的密闭性及隔热性，窗户的面积根据房间的尺寸来确定。底层、半地下室及地下室的外窗应采取防虫及防啮齿动物的措施。

4.门

由一个标准单元组成的实验室的门洞宽度应为0.8—0.9m，高度不应小于2.10m。由一个及以上标准单元组成的实验室的门洞宽度不应小于1.2m，高度不应小于2.1m。有特殊要求的房间的门洞尺寸应按具体情况确定。实验室的门扇应设观察窗。

5.缓冲间

实验室缓冲间的面积一般为1300*（1300或1500）mm为宜，并且缓冲间的面积不能大于实验室房间面积的1/8。

6.设备间距

    靠两侧墙布置的边实验台之间的净距不应小于1.5m当靠一侧墙改为布置排毒拒或实验仪器设备时，其与另一侧实验台之间的净距不应小于1.8m，由一个标准单元组成的常规实验室。靠两侧墙布置的边实验台与房间中间布置的岛式或半岛式中央实验台之间的净距不应小于1.5m。布置排毒拒或实验仪器设备时，其与实验台之间的净距不应小于1.8m实验台的端部与走道墙之间的净距不宜小于1.2m。

7.走廊

    单面布房最小净宽不应小于1.3m，单走道双面布房最小净宽不应小于1.6m，走廊地面有高差时，当高差不足二级踏步时，不得设置台阶，应设坡道，其坡度不宜大于1：8。

六 临床基因扩增实验室的平面布局要素

    生物安全防护水平为二级的实验室适用于操作能够引起人类或者动物疾病，但一般情况下对人、动物或者环境不构成严重危害，传播风险有限，实验室感染后很少引起严重疾病，并且具备有效治疗和预防措施的微生物。基因检验实验室的所需的样本一般情况下正好符合二级防护的要求范围，即可有效利用安全隔离装置(如：生物安全柜)操作常规量经空气传播致病性生物因子的实验室。所以，基因扩增实验室的标准一般按照二级生物安全防护水平进行设计，即所谓的P2标准或者BSL-2标准进行防护等级设计。

1、实验室设计原则与标准

    根据《GB 19489》的要求，基因扩增实验室应符合以下的要求：

v 实验室选址、设计和建造应符合国家和地方环境保护和建设主管部门等的规定和要求。

v 实验室的防火和安全通道设置应符合国家的消防规定和要求，同时应考虑生物安全的特殊要求；必要时，应事先征询消防主管部门的建议。

v 实验室的安全保卫应符合国家相关部门对该类设施的安全管理规定和要求。

v 实验室的建筑材料和设备等应符合国家相关部门对该类产品生产、销售和使用的规定和要求。

v 实验室的设计应保证对生物、化学、辐射和物理等危险源的防护水平控制在经过评估的可接受程度，为关联的办公区和邻近的公共空间提供安全的工作环境，及防止危害环境。

v 实验室的走廊和通道应不妨碍人员和物品通过。房间的门根据需要安装门锁，门锁应便于内部快速打开。

v 应设计紧急撤离路线，紧急出a应有明显的标识。需要时(如：正当操作危险材料时)，房间的人口处应有警示和进人限制。

v 应评估生物材料、样本、药品、化学品和机密资料等被误用、被偷盗和被不正当使用的风险，并采取相应的物理防范措施。

v 应有专门设计以确保存储、转运、收集、处理和处置危险物料的安全。

v 实验室内温度、湿度、照度、噪声和洁净度等室内环境参数应符合工作要求和卫生等相关要求。

v 实验室设计还应考虑节能、环保及舒适性要求，应符合职业卫生要求和人机工效学要求。

v 实验室应有防止节肢动物和啮齿动物进人的措施。

2、实验室设施和设备要求

根据《GB 19489》的要求，基因扩增实验室根据BSL-2安全防护等级，其实验室设施和设备要求如下：

Ø 实验室的门应有可视窗并可锁闭，门锁及门的开启方向应不妨碍室内人员逃生。实验室主入口的门、放置生物安全柜实验间的门应可自动关闭；实验室主入口的门应有进人控制措施。

Ø 在靠近实验室的出口处宜设置洗手池。

Ø 在实验室门口处应设存衣或挂衣装置，可将个人服装与实验室工作服分开放置，每个实验室的缓冲间内设置存衣或挂衣装置，每个实验室的衣服应有区分标志。

Ø 验室的墙壁、天花板和地面应易清洁、不渗水、耐化学品和消毒灭菌剂的腐蚀。地面应平整、防滑，不应铺设地毯。

Ø 实验室台柜和座椅等应稳固，边角应圆滑。实验室台柜等和其摆放应便于清洁，实验台面应防水、耐腐蚀、耐热和坚固。

Ø 实验室应有足够的空间和台柜等摆放实验室设备和物品。应根据工作性质和流程合理摆放实验室设备、台柜、物品等，避免相互干扰、交叉污染，并应不妨碍逃生和急救。

Ø 实验室内应避免不必要的反光和强光。

Ø 应在生物操作实验室内设洗眼装置，必要时应设紧急喷淋装置。

Ø 应在操作病原微生物样本的实验间内配备生物安全柜。

Ø 应按产品的设计要求安装和使用生物安全柜。如果生物安全柜的排风在室内循环，室内应具备通风换气的条件；如果使用需要管道排风的生物安全柜，应通过独立于建筑物其他公共通风系统的管道排出。

Ø 若使用高压气体和可燃气体，应有安全措施，应符合国家、地方的相关规定和要求。

Ø 应设应急照明装置。

Ø 应有足够的电力供应，应有足够的固定电源插座，避免多台设备使用共同的电源插座。应有可靠的接地系统，应在关键节点安装漏电保护装置或监测报警装置。必要时，重要设备(如：培养箱、生物安全柜、冰箱等)应配置备用电源。

Ø 供水和排水管道系统应不渗漏，下水应有防回流设计。

Ø 应配备适用的应急器材，如消防器材、意外事故处理器材、急救器材等。

Ø 应配备适用的通讯设备。

Ø 必要时，应配备适当的消毒灭菌设备。应在实验室或其所在的建筑内配备高压蒸汽灭菌器或其他适当的消毒灭菌设备，所配备的消毒灭菌设备应以风险评估为依据。

 

           

人流组织

    临床基因扩增实验室入口处可设缓冲间，保持人净路线的合理性，每个实验室有独立的缓冲间，如果条件不具备，各实验室的独立缓冲间也不能少。

特殊要求临床基因扩增实验室建议一定具有淋浴区，这样有利于减少污染源与外界环境的接触，如果临床基因扩增实验室不具备淋浴条件，则一定要做好衣物及各种用品的隔离防护措施。如下图：

  

                    

b、物流路径

洁净室内设备和物料出人口应根据设备和物料的性质、形状等特征设置物料净化用室及其设施。物料净化用室的布置应防止净化后物料在传递过程中被污染。

c、污物路径

洁净室内设置污物处理间，实验室产生的废弃物经过消毒处理后通过传递窗传递到室外，由专业的医疗废弃物回收公司进行回收处理。

人流、物流、污物流不得走同一通道，跨越不同级别区域的物品可由传递窗传递。

d、消防逃生组织

消防逃生组织指实验室的消防逃生通道，实验室在设计的时候要考虑一旦出现特殊情况，实验室内部工作人员能最便利逃生到安全区域内，可在实验室内增加安全门或者逃生通道来实现和满足消防需求。

一个临床基因扩增实验室保持两个方向相反的安全出口。

e、生物安全性需求

生物安全性需求主要是指气流的流向和压力要求，临床基因扩增实验室的空气流向可按照试剂储存和准备区→标本制备区→扩增区→扩增产物分析区空气压力逐渐递减方式进行，防止扩增产物顺空气气流进入扩增前的区域。一般来说试剂储存和准备区与标本制备区呈微正压，扩增区和扩增产物分析区呈微负压。样本制备——扩增区——扩增产物分析区压差5帕左右递减即可。

七 暖通设计

暖通设计是临床基因扩增设计中最为核心的内容。

1、设计原则

临床基因扩增实验室没有严格的净化要求，若需要一般采用净化级别8或9级（即万级或十万级），防止污染和交叉污染是设计关键。

    合理的空调通风系统设计，空调系统尽量采用全新风全排风气流组织形式，为保证压差梯度空调系统与生物安全柜、通风橱排风合理配置。

2、空调布置形式

临床基因扩增实验室空调通风系统按照布置方式分为分散型空调系统、集中型空调系统及局部集中型空调系统。

分散型空调系统：各实验室分别用独立的空调机，但这样要求室外主机与室内机的距离不能太远，适用于实验室之间没有特别压差或洁净度要求的实验室辅助功能间，常见于投资少，规模小的建设项目。

集中型空调系统：采用统一制冷机组，管道统一布置，温度、湿度、换气设计统一设计，适用于压差和净化要求的主要功能间。

局部集中型空调系统：采用多个空调机组，对实验功能间空气环境有不同要求的区域分开控制，同时还可采用变频控制系统，根据使用区域的变化而改变能耗，从而实现节能的目的。

3、空调选型方法：

 

（一）根据空调的系统构成原理：主机+末端

    主机：

    明确项目现场是否有冷热源，是否具有冷冻水，现场是否具有蒸汽源，现场是否具有热水等。

    如果现场均不具备或者部分条件具备的话则需要考虑配备对应的主机设备。

    对于目前净化行业来说主机的选择考虑的因素：

⑴负荷的大小问题

⑵内机与外机的距离问题

⑶室内工况点和精度的要求问题

⑷室外夏季和冬季的极端负荷问题

   针对目前净化行业市场系统，用到的空调机组主要两类：

⑴整套净化直膨机组

⑵水系统主机+组合式净化空调箱

（二）净化——依靠末端达到净化目的

    不同场合选择净化空调机组的功能段不同（选择的几个特例场所）。

 

 

    净化项目上选择厂家空调设备还需要考虑下面几个问题点：

⑴机组的内部的截面风速问题，一般不建议截面风速超2.5m/s。

⑵机组内部功能段的合理排不问题，不同场合的功能段需要针对项目区特殊设计。

⑶机组的板厚承压问题，板厚承压不够的情况会造成箱体变形甚至损坏。

⑷机组内部各种方式的选择问题，根据现场条件和使用场所而定。

    净化组合式空气机组设备注重的问题（根据空调行业的制造标准）

⑴漏风率（净化行业要求组合式空调器漏风率＜2%）；

⑵箱体强度（因为净化项目末端一般带有高效过滤，机组的机外静压相对较大）；

⑶洁净度（净化行业本身要求的是不是带来二次污染）；

⑷冷桥（减少运营费用）；

⑸噪声（跟机组的功能段排布和资材选择有关）。

 

（三）组合式空调机组采取的措施

    从箱体的结构跟生产的工艺上去避免主要的问题

 

 

（1）漏风率

    采用迷宫式结构处理，漏风途径中采用密封弹性体挤压密封，减少风的外漏。

（2）箱体强度

    板材跟板材之间通过螺栓螺母连接，板跟发泡聚氨酯材料通过异形爪状设备，牢固爪和在一起，减少板跟聚氨酯填充料的脱离，其次在箱板内部加入龙骨，增强板材的承压问题。大风量机组在机组内部做加强支撑结构，避免机组运行的形变问题。

（3）洁净度（净化行业本身要求的是不是带来二次污染）

    通过箱体结构的挤压成圆弧设计，避免90°直角产生，避免机组内部有积灰死角，减少机组的二次污染问题。

（4）冷桥（减少运营费用）

    板材采用异形的设计，在可传递冷热量材料间加入高强度段冷桥型材，较少冷热量的损失。

（5）噪声（跟机组的功能段排布和资材选择有关）

    选择优质厂家的风机电机材料，在质量上把关严格，其次在风机电机位置采用整体底框跟机组内底板采用弹簧减震处理，达到噪声的最大优化。

 

4、空调设计的几个要素

（1）气流组织

气流组织是指如何组织空气在市内以某种流动方式在室内进行循环和进出的形式。

临床基因扩增实验室必须保持一定的气流状况，通常实验室相对于走廊及非实验室区域保持负压，气流从低危区流向高危区，整体建筑对外界保持正压，以防止有害的未经过过滤处理的气体渗入。

实验室内各种设备的位置应有利于气流由“清洁”空间向“污染”空间流动，最大限度减少室内回流与涡流。各区之间的气流方向应保证由清洁区流向半污染区，由半污染区流向污染区。实验室的清洁区内宜设一间正压缓冲室。

实验室的空气单向流流向应该为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向流动。扩增前区保持微（弱）正压状态，扩增后区保持微（弱）负压状态。

实验用品单向流工作流向应该为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区，不得逆向进行。实验用品包括实验材料（试剂、样品和扩增产物）、实验器材（容器、板架、实验服装、帽子、口罩、手套、鞋套）、办公用品（记录纸、笔）、以及清洁工具等。物品的传送是通过互锁式传递窗传递。
    实验人员单向工作流流向应该为：进入各工作区域严格按照试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区单一方向进行，不得逆向走动。原则上实验人员应在扩增后区工作后当天不得再返回扩增前区工作。

    实验室的单向清洁流流向应当为：试剂储存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区的方向进行。不同的实验区域应当有各自的清洁用具，以防止交叉污染。

气流组织应采用上送下排方式，送风口和排风口布置应使室内气流停滞的空间降低到最小程度。

在充分考虑布局合理的前提下，充分考虑送风口、回风口以及排风口的位置，送回排风量的匹配，建立房间之间合理的压力梯度，保证空气有序流动，防止交叉污染。

不同洁净等级或不同功能间的压差，通常为5-10pa。

要充分考虑人流、物流、污物流的路线，最大限度的减少室内的回流和涡流，避免污染物扩散到室内，危害人员和环境的安全。特别注意排风柜对室内气流面积的影响，在实验室排毒柜、生物安全柜附近的区域应尽量避免紊流的出现，紊流在罩边的影响远比在罩前的影响大。

气流的压力控制主要有直接压差控制法和余风量控制法。

直接压差控制法：

通过压差传感器测量室内与参照区域的压差，与设定的压差比较后，控制器根据偏差调节送风量（或排风量）进行控制，从而达到要求的压差，此种压力控制为反馈控制，系统的响应时间长，控制精度低。

余风量控制法：

实验室的送风量与排风量保持一顶的风量差（称为余风量）必然会导致室内外一定的压差，当室内总送风量大于室内回风、排风总量时，空气通过余压阀和房间缝隙排出，与相邻区域建立起正压，避免环境中的污染物进入室内，如要求洁净度较高的场所。

当房间总送风量小于回风、排风总量时，空气通过相邻房间或室外进入室内，室内呈负压。此类负压视为了保证环境的安全，保证未经处理的污染物不会流向室外。
    对于压力控制精度高且需要压力稳定的场所，多用余风量控制法，同时加入压力传感器和控制器对余风量进行设定，以产生压差的余风量确定送、排风量，同时对余风量进行检测，当余风量偏离设定值达到一定程度时，系统自动报警，此时需要对测量装置或可能产生漏风量的设备进行吹，余风量控制与压力控制相结合，可以实现系统的动态控制，确保压力系统压差的准确。

（2）送风系统

主要有送风机、管道、风阀、中效过滤或高效过滤送风口，送风系统新风口应采取有效的防雨措施，安装保护网，且应高于室外地面2.5m以上，同时应尽可能远离污染源。

临床基因扩增实验室实验过程中或存在有毒有害有味的气体，所以核心功能间全部采用室外空气的系统，但其能量损耗最大。

全新风特点：

1) 全部空气量都来自室外，经过处理后送入室内。

2) 室内的回风口不是把空气吸回系统，而是送入排风管道，由排风机或再经处理排至室外，每个房间可以单独排放，也可以几个房间联合排放。

3) 排风量小于送风量时，室内保持正压，反之为负压。

全新风范围：试剂储存和准备区、标本制备区、扩增区、扩增产物分析区均为全新风，辅助功能间、洗衣间、洁具间、器具清洗间、污物暂存间可独立空调系统，采用多联机空调或常规循环风系统。

    样本库放在冷库可单独设备用双空调系统，无冷库的样本库内放置多个冰箱，具有较大热量，可由独立单制冷空调实现，保证冬天温度较低。

测序区需恒温恒湿常规循环风系统。

在生物安全柜操作面或其他有气溶胶操作地点的上方附近不得设送风口。

送风量核算时需考虑弥补通风橱、生物安全柜开启时所排风。临床基因扩增实验室生物安全柜最低要求可30%风量外排，70%风经过滤排至室内再循环。

（3）排风系统

一般有排风管道、消声器、风机、风阀、排风口、生物安全柜排风、通风橱排风、控制系统。

对于临床基因扩增实验室，如果室内排除的气体没有腐蚀性，通风管道可以采用镀锌钢板，对于产生腐蚀性气体的实验室，风管应从耐腐蚀材料的PVC风管或玻璃钢风管。室外采用玻璃钢风管或镀锌板风管。

圆形风管采用插接连接，矩形风管采用法兰方式连接，根据实际情况也可采用插件方式连接。

风机主要有轴流风机、斜流风机、离心风机。

轴流风机适用于风压小、管路短的通风系统，如直接排至室外或窗外的通风系统。

玻璃钢离心风机适用于管路长的通风系统，如通过风管井或外墙接管排至屋顶，简称屋顶排放。风机的材质，一般分为玻璃钢、PP、PVC等。风机的型号根据风量和风压选择。

生物安全柜和通风橱有单独排风机可以独立排风，也可同房间内排风一起排至主管道，主管道设置主排风机经过处理后排至室外。

排风口应设在室内被污染风险最高的区域，单侧布置，不得有障碍。排风口下边沿离地面不宜低于0.1m，且不应高于0.15m；上边沿高度不宜超过地面之上0.6m。排风口排风速度一般不应大于1m/s。

实验室的排风必须与送风联锁，排风先于送风开启，后于送风关闭。

生物安全实验室房间的排风管道可以兼作生物安全柜的排风管道。排风系统应能保证生物安全柜内相对于其所在房间为负压。

实验室必须设置室内排风口，不得只用安全柜或其他负压隔离装置作为房间排风口。

操作过程中可能产生污染的设备必须设置局部负压排风装置，并带高效空气过滤器。

（4）生物安全柜类型

生物安全柜生物安全柜是防止操作者和环境暴露于实验过程中产生的生物气溶胶的负压过滤排风柜，是防止实验室获得性感染的主要设备。

Ø 气溶胶 是指悬浮于气体介质中、粒径一般为0.001μm～100μm的固态、液态微粒所形成的胶溶态分散体系。

Ø 生物安全柜领域执行的重要标准有欧洲标准EN12469：2000和美国国家卫生基金会的第49号标（NSF49）等。

Ø 我国于2006年正式实施《中华人民共和国医药行业标准：生物安全柜》 （YY0569-2005）。

Ø 根据气流及隔离屏障设计结构，将生物安全柜分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级（YY0569-2005）。

 

Ⅱ级生物安全柜原理：生物安全柜是指用于保护操作人员、处理样品安全与环境安全的通风安全柜前窗操作口向内吸入的气流用以保护操作人员的安全；工作空间为经高效空气过滤器净化的垂直下降气流用以保护产品的安全；柜内的气流经高效空气过滤后排出，以保护环境不受污染。

Ⅱ级生物安全柜按排放气流占系统总流量的比例及内部设计结构，将其划分为A1、A2、B1、B2四个类型。

 

 

                                           （待续）