上海伯杰手足口病EV71全基因测序及实例分析

2017-07-04 08:44:30伯杰病毒

一、什么是手足口病？

手足口病(hand，foot and mouth disease)是世界范围内流行的儿童常见病，可由多种病毒感染引起，以发热和手、足、口腔等部位出现皮疹或疱疹为主要特征。少数患儿可出现脑炎、急性弛缓性麻痹、脑水肿和心肌炎等严重并发症。病情进展快，易发生死亡。近十多年来，手足口病在许多国家和地区，特别是亚太地区发生过多次较大规模的暴发或流行，引起一定数量儿童的死亡，越来越受到各国的关注。

二、引起手足口病常见病毒有哪些？

一般引起手足口病常见肠道病毒型别为肠道病毒71型（EV71），柯萨奇病毒A16型（CA16），柯萨奇病毒A10型（CA10），柯萨奇病毒A6型（CA6）以及其他肠道病毒。2008年3—5月，安徽省阜阳市发生手足口病暴发疫情，共报告6882例病例，其中有168例重症病例，死亡23例，发病率为82／10万。2008年5月2日，中国将手足口病纳入丙类法定传染病报告与管理。其中EV71病毒常引起重症死亡病例，所以是重点关注病例。

三、手足口病主要病原和流行趋势

手足口病发病存在连续2年高发、隔1年或隔2年出现较大规模暴发的情况；而EV71感染高发存在着隔2年一高发的特点。但每次暴发的流行毒株大多不同，2012年-2017年中国大陆地区手足口主要病毒亚型为：EV71+CA16，EV71；EV71+CA16，CA16；CA16+CA6，EV71。对当地进行手足口病毒株的分子流行病学监测，掌握毒株的变化趋势，对于预测和评估手足口病疫情的规模和严重程度有重大的意义。

四、EV71主要基因型有哪些？

因为EV71常导致重症病例，EV71基因型别的变化和易感宿主的累积被认为是手足口病在某一地区间歇性暴发或流行的主要原因，所以EV71的基因测序研究具有重要意义。EV71分3个基因型(A、B和C型)和11个基因亚型(BrCr、B1-B5和C1-C5亚型)。中国大陆地区自1999-2008年一直为C4亚型。EV71为何会在很多国家和地区引起大规模的暴发或流行，并伴有很高的病死率，这其中的原因目前尚不清楚。病毒变异或重组、家庭内传播的病毒载量高于普通人群、易感人群的积累和个体遗传的易感性、医生缺乏对此病的认识可能都是相关因素。

五、测序实例分析

2017年全国不少省市报道了EV71引起的重症病例，上海伯杰受北方L市CDC委托，对11例重症手足口患者（已用荧光PCR确诊为EV71型，Ct值在28-31之间）的粪便标本中的病毒进行全基因测序。考虑到标本是来源于粪便，与疱疹液相比里面杂菌比较多，会影响测序扩增。所以标本前处理加入了过滤除菌，抽提之后加入降解干扰背景核酸等步骤。将处理后的核酸标本按照伯杰设计的引物进行全基因扩增（基因全长7400bp±，设计9个片段），扩增产物上机器测序，其中5个标本全部扩增出条带，6个标本扩增出部分条带。对产物测序之后，根据测序获得的序列进一步修正引物再次扩增未扩增出的条带。最终获得全基因序列，经过分析证实C4a基因型，另外其中3个来自同一班级的标本基因高度类似，说明了相互传染的可能。