基因编辑系列（一）：初谈基因编辑的发展史
最近一段时间，想必大家的朋友圈都被王健林的“小目标”刷屏了吧。生物界的筒子们，为了让你们充实愉快地度过这国庆假期，今天就跟小编一起定个小目标，学学基因编辑如何发家致富的吧。
现今，基因编辑已经广泛应用于生物医学的很多领域，如疾病机理研究、基因治疗及动植物遗传育种等，不仅仅是生物领域的同行们，就连菜市场的大妈大爷都知道转基因这回事了。那所谓的基因编辑如何科学的解释，它又是如何一步步发展起来的呢？
基因编辑（gene-editing）的基本原理其实就类似word程序中的查找、替换或者删减过程，即人为地修饰宿主细胞DNA序列后，实现对特定的目的基因片段的“编辑”——敲除/敲入，从而达到改变宿主细胞的基因型的目的。
随着科学技术不断进步，基因编辑技术已经日益成熟，想要实现对基因组的编辑变得不再那么困难，特别是第三代技术CRISPR/Cas9的出现，目前被认为是最简单高效的基因编辑手段，下面小编就带着大家看看基因编辑的发展历史。
第一代技术： ZFN（锌指核酸酶）
出现时间：1996年
组成单元：识别特定的DNA序列的 ZFN ＋核酸内切酶FOKI
发现：锌指结构域（Zinc Finger Nucleases , ZFN）是真核生物中最为普遍的DNA结合模块
作用原理：
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一对人工设计的，识别特异DNA序列的锌指核酸酶ZFN与目标DNA序列结合；
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FokI核酸内切酶将形成二聚体，从而割DNA双链，形成双链断裂 ( double strand break, DSB)，DNA损伤后修复会造成基因敲除或敲入等。
通过加工改造ZFN的DNA结合域，便可靶向不同的DNA序列，进行特异性切割。
ZFN的结构及作用原理图（引自文献1）
应用：
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构建基因编辑的模式动物；
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遗传育种；
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基因治疗。
优点：设计比较简单，效率较高。
缺点：1. 劳动量大，周期长； 2. 成功率低易脱靶； 3. 细胞毒性大。
重大突破：Sangamo Biosciences公司基于ZFNs技术治疗艾滋病CCR5的方法已经进入临床II期试验，这是史上第一次应用基因编辑技术来治疗人类疾病。
第二代技术：TALEN（转录激活样效应因子核酸酶）
出现时间：2011年
组成单元：识别特异DNA序列的蛋白分子TALE ＋核酸内切酶FOKI
发现：源于黄单胞菌属（Xanthomonas）植物病原菌，它通过 III 型分泌系统将效应蛋白（TALEN（Transcription Activator-likeeffector, TAL effector））输入植物细胞质内，类似于模拟真核细胞转录因子对宿主细胞进行重编程。
作用原理：
TALEN的结构及作用原理图（引自文献1）
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人工设计识别特异DNA序列的TALEN与目标DNA序列结合；
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FokI核酸内切酶切割DNA双链，双链断裂DNA后，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等。
TALEN包括中间串联重复结构域，核定位信号以及酸性转录激活结构域，且高度保守。TAL效应因子对靶点的特异性是由重复模块数目和排列顺序决定的。
应用：
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构建基因编辑的模式动物；
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遗传育种；
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基因治疗。
优点：平台比较成熟。
缺点：1. 依赖上下游序列；2.脱靶率较高；3. 具有细胞毒性。
重大突破：2012年的《科学》（Science）则将TALEN技术列入了年度十大科技突破；
Cellectis公司用TALEN改造的基于异源基因的CAR-T——UCART19成功缓解了Layla的不治之症–急性淋巴细胞性白血病（ALL）。
第三代技术：CRISPR/Cas9（成簇的规律性间隔的短回文重复序列）
出现时间：2013年
组成单元：成簇的规律性间隔的短回文重复序列CRISPR + 核酸内切酶Cas9
发现过程：CRISPR系统是古细菌和细菌的一种不断进化适应的免疫防御机制，早在1987年发现大肠杆菌里有串联间隔重复序列，直到2002年被命名为CRISPR（Clusteredregulatory interspaced short palindromic repeats）。2012年CRISPR/Cas9的详细作用机制被发现，并预测可作为基因编辑技术。
作用原理：人工设计的gRNA（ guide RNA）来识别目的基因组序列，并引导Cas9蛋白酶进行有效切割DNA双链，形成双链断裂，损伤后修复会造成基因敲除或敲入等。
应用：
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构建基因编辑的模式动物；
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遗传育种；
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基因治疗。
优点：较前两代技术更加高效、快捷、准确、廉价。
缺点：1. 有局限性，靶序列前无PAM序列不能切割；2. 仍存在一定的脱靶效应。
重大突破：已成立多家CRISPR相关公司，致力于用来治疗基因遗传病，已在很多疾病取得较好临床前效果。
CRISPR/Cas9系统组成及作用原理图（引自文献2）
以上三种技术的共同点：切割DNA后造成的损伤及修复过程
DNA链断裂后，主要通过易错性的非同源末端连接（Non -homologous end joining, NHEJ）以及高保真性的同源重组（homologous recombination, HR）进行修复，最终会造成基因敲入（knock in）、敲除（knock out）、缺失（deletion）及基因修饰（gene modification）这几种类型。
DNA损伤后介导的修复途径（引自文献3）
基因编辑看似很高大上，又很深奥的知识，其实大家用心地经历本次的学习后，相当于已经迈向了很大一步了。总结一下，基因编辑技术至此已经发展到第三代，一代比一代高效快捷，陆续也一直有新技术出现，相信编辑基因组DNA会更加简单。
参考文献
Thomas Gaj, Charles A. Gersbach, and Carlos F. Barbas III.(2013) ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trendsin Biotechnology, 31(7): 397-405.
DiCarlo, Julie E. Norville1, George M. Church. (2013)RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science, 339(6121): 823-826.
Tomoji Mashimo. (2014) Gene targeting technologies inrats: Zinc finger nucleases, transcription activator-like effector nucleases,and clustered regularly interspaced short palindromic repeats. DevelopmentGrowth Differentiation, 56(1): 46–52.
